生物科学毕业设计（论文）-沙门氏菌X4062染色体-质粒平衡致死系统的构建.doc

本 科 毕 业 论 文沙门氏菌x4062染色体-质粒平衡致死系统的构建xxx200830710116指导教师 xxx 教授学院名称生命科学学院 专业名称生物科学论文提交日期2012年4月6日 论文答辩日期2012年 5 月答辩委员会主席 _评 阅 人 _摘 要 鉴于临床多种耐药性菌株不断产生和迅速水平传播扩散，fda ( food and drg administration食品与药物管理机构)已禁止在重组菌生产中使用抗生素和含抗药性基因作为筛选标志的载体质粒。染色体-质粒平衡致死系统是近年来发展起来的一类以非抗生素作为筛选标记的载体表达系统，它的宿主菌通常是一类染色体管家基因的突变体，该缺陷型菌株不能在基本培养基上生长，当导入带有其完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式构成染色体-质粒平衡致死系统，此时互补质粒对其宿主菌的生长起到功能性互补的作用，一旦质粒丢失，细菌则由于不能合成必需物质而死亡。基于减毒沙门氏菌染色体上asd基因的已知序列，利用噬菌体的red同源重组系统一步法构建沙门氏菌x4062的asd基因缺失突变株x4062 asd:cat，在二次重组中利用携带能够表达flp位点特异性重组酶基因的质粒pcp20介导二次同源重组，以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合pcr扩增和测序结果，证明沙门氏菌x4062asd缺失突变株的正确构建。另外，从沙门氏菌x4062基因组中扩增出asd基因片段，将该片段整合到带有表达荧光蛋白基因的质粒pegfp中，命名为pmd-asd。缺失突变株失去了在普通lb培养基上生长的能力，只有添加dap或导入含有asd基因的质粒（pmd-asd）才能在lb培养基上生长，与原型沙门氏菌x4062比较，其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致，基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统。关键词：fda 沙门氏菌 受体菌 red重组系统 asd基因缩略语及英汉对照amp ampicilin氨苄青霉素cmchloroamphenicol氯霉素fda food and drg administration食品和药物管理局dapdiaminopimelic acid二氨基庚二酸asd aspartate semialdehyde dehydrogenaseasd基因ddh2o double distilled water双蒸水dntps deoxyribonucleoside triphosphate三磷酸脱氧核糖核苷lb luria-bertani细菌基础培养基h hour小时min minutes分钟ml milliliter毫升mmol millimolar 毫摩尔molmolar摩尔pcr polymerase chain reaction聚合酶链式反应rpm round per minute 每分钟转数sseconds秒rnaribonucleic acid 核糖核酸l micro litre 微升mol micro molar 微摩尔structure of salmonella x4062 chromosome-plasmid balance to death systemliu yongwei(college of life science, south china agricltural university, guangzhou 510642, china)abstract：in view of a variety of resistant strains of clinical continuously producing and quickly spreading, the fda ( food and drg administration ) has banned recombinant strains used in production and contain antibiotics resistance genes as the carrier of screening mark plasmid. chromosome-plasmid balance to death system is developed in recent years to class with the antibiotic selection markers as the carrier of expression system. it usually is a kind of host bacterium chromosome steward of the mutant gene. the defects type strains cant grow in basic medium and while the complementary plasmid with complete genetic is imported in it, the plasmid and the defect type strains will structure a chromosome-plasmid balance to death system as genetic complementary. at this time, the complementary plasmid plays a functional complementary role which host the growth of the host bacterium. once the plasmid lost, the host bacterium woldnt be able to synthesis necessary material and death. based on the known sequences of the gene asdon the chromosome of reduction poison salmonella, structure the salmonella x4062s mutation without gene asd, x4062 asd:cat. in the second restructuring, make the plasmid pcp20 carrying the gene which can express flp site specificity restructuring enzyme use of mediating the second homologous restructuring to remove the chloramphenicol resistance screening gene of the lack mutation in the above. combined with the reslt of pcr amplification and sequencing, prove that the salmonella x4062s lack mutation is structured correctly. moreover, copy the gene asd fragment from the genome of salmonella x4062 and combine it in the plasmid pegfp with the gene express fluorescent protein, named pmd-asd. the lack mutations lost arent able to grow in the ordinary lb medium until adding dap or importing the plasmid with gene asd(pmd-asd). compared with salmonella x4062 prototype, their growth speed, growth logarithm period and the transformation efficiency of accepting the plasmid in different number of copies are nearly consistent. based on the lack mutations construct the salmonella chromosome-plasmid balance to death system with asd nutrition gene as sign.key words: fda salmonella receptor bacteria red reorganization system gene 目 录1 前言11.1 减毒沙门氏菌载体系统的研究进展11.1.1 减毒细菌活载体疫苗11.1.2 减毒沙门氏菌活载体疫苗的应用11.1.3 减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制21.1.4 沙门氏菌的减毒21.2 研究意义与目的61.3 研究内容61.4 技术路线62 材料与方法72.1 实验材料、试剂和仪器72.1.1 毒株、细胞、菌株及质粒72.1.3 培养基、试剂的配制72.1.4 仪器和器材92.2方法92.2. 减毒鼠伤寒沙门氏菌asd缺失株的构建92.2.1 菌株与质粒92.2.2 引物设计102.2.3 asd基因的制备102.2.4 含frt位点和cat基因的同源重组片段的制备和纯化112.2.5 沙门氏菌电转感受态细胞的制备122.2.6 重组酶质粒pkd46的转化和诱导表达122.2.7 asd基因的敲除132.2.8 沙门氏菌asd:cat的鉴定132.2.9 氯霉素抗性基因的去除132.3 含egfp的双启动子互补表达载体pcla-egfp的构建142.3.1 表达载体pcla-egfp的构建策略142.3.2 载体构建所用引物142.3.3 重组质粒pcla-egfp的构建162.3.4 pcla-egfp质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌x4062（asd）中的表达192.3.5 pcla-egfp质粒在x4062（asd）中的体外遗传稳定性实验193 结果与分析193.1 减毒鼠伤寒沙门氏菌asd缺失株的构建193.1.1 asd基因的制备193.1.2 含frt位点和cat基因的同源重组片段的制备203.1.3同源重组菌 (asd:cat)的 pcr鉴定213.1.4重组菌沙门氏菌asd 的鉴定223.2 重组质粒pcla-egfp的构建及鉴定233.2.1 pcl-egfp片段的扩增233.2.2 asd基因的扩增233.2.3 重组质粒pcla-egfp的鉴定243.3 重组质粒pcla-egfp在鼠伤寒沙门氏菌x4062asd中的表达243.4 pcla-egfp质粒在x4062（asd）中的体外遗传稳定性253.5重组菌x4062asd（pcla-egfp）表达产物的sds分析254 讨论26参考文献28致 谢32附 录33华南农业大学本科专业毕业论文成绩评定表34371 前言1.1 减毒沙门氏菌载体系统的研究进展1.1.1 减毒细菌活载体疫苗载体疫苗是将所需的编码病原特异性抗原的dna片段插入减毒的活细菌或病毒载体，以提呈表达所编码的抗原，以期达到预防一种或多种疾病的作用。重组细菌疫苗载体大多数利用共生细菌或者减毒的病原菌作为载体，利用减毒病原菌作为载体，可以同时产生针对异源抗原和载体病原菌的免疫反应。减毒细菌活载体疫苗因其能够刺激机体产生针对活载体及其携带的外源抗原的体液、细胞免疫和局部粘膜免疫受到人们的广泛关注。减毒细菌通过口服进入机体，诱导机体产生针对特定抗原的各种免疫应答。减毒细菌通过突变其某些致病基因，使其毒性降低，由于减毒的微生物仍有一定的感染性，可以模拟天然的疾病发生过程，通过口服，进入肠道相关淋巴组织，因此可以全方位地激活机体免疫系统，从而产生粘膜免疫应答及全身免疫应答（王芳，2002）。目前一些病原菌，如李斯特菌、沙门氏菌、耶尔森菌、志贺氏菌及分支杆菌己经被广泛用作载体菌携带外源抗原，而一些有益的微生物也成功地被用做载体，如乳酸菌为载体的疫苗，它们可以以食物的形式进入体内，也可以通过阴道途径进行免疫（童光志，2009）。减毒细菌活载体疫苗的优点：培养方便，生产成本相对低廉，适用于大范围内的免疫接种；免疫方法简便易行，可以通过口服和鼻腔接种；高效的免疫原性，能够刺激机体的全身免疫；可以携带较大的基因片段，易于构建多价疫苗。1.1.2 减毒沙门氏菌活载体疫苗的应用沙门氏菌 (salmonella)是寄生于人类和动物肠道，内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。沙门氏菌无芽胞，无荚膜，多数有菌毛，鞭毛。沙门氏菌是肠杆菌科的重要病原菌属，到2007年为止已发现2579种血清型（patrick a. d. grimont,2007）。沙门氏菌属分为两个种名，分别是salmonella enterica和salmonella bongori，其中salmonella enterica又分为六个亚种。绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性，能引起人和动物的多种不同临床表现的沙门氏菌病。1892年首次从鼠身上分离出鼠伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium，st），1893年证实该菌可引起食物中毒，明确了该菌可以使人、鼠共同致病。鼠伤寒沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，表达外源抗原的减毒沙门氏菌经口服免疫后，能激发机体产生分泌型抗体、体液免疫和细胞免疫（cardenas et al,1992）;（darji et al,2000），并已应用于细菌（wang et al,2009）、病毒（chinombe et al,2009）、寄生虫（qu et al,2008）、肿瘤（shahabi et al,2010）等疫苗的研制。沙门氏菌还可以成功地把dna疫苗转移至细胞内（darji et al,1997）。野生型沙门氏菌对机体有毒性作用，通过突变沙门氏菌毒力基因的方式构建减毒沙门氏菌菌株，限制其致病性，可以提高沙门氏菌作为基因及其产物传递工具的安全性。正是这些特性使减毒沙门氏菌成为一种具吸引力的，能够将外源抗原转至哺乳动物免疫系统的表达载体。1.1.3 减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制沙门氏菌进入体内的途径有两种：一种是以m细胞为代表的上皮细胞途径，另一种是非上皮细胞途径。具有侵袭力的沙门氏菌可选择性地侵入派伊尔结（peyers patchs，pps）的m 细胞。m 细胞是1974 年 owen 在粘膜淋巴结的滤泡相关上皮（follicle associated epithelia，fae）中发现了一种特殊的扁平上皮细胞，因其表面有微小的皱褶，又称微皱褶细胞（赵燕等，2001）。沙门氏菌入侵m细胞后被抗原呈递细胞（apc）捕获然后 apc 再与相关免疫细胞相互作用，从而产生免疫应答或造成机体感染。沙门氏菌还可通过吞噬细胞直接吞噬的非上皮细胞途径侵入机体。vazquez-torres等发现cd18+吞噬细胞可在肠道直接吞噬沙门菌并将其运送至脾脏（vazquez-torres et al,1999）。rescigno等发现dcs具有细菌摄取能力，dcs通过打开肠道上皮间的紧密连接，直接进入肠腔吞噬沙门菌（rescigno et al,2001）。沙门氏菌被巨噬细胞或者树突状细胞吞噬后，一方面刺激机体产生免疫应答，一方面被转运到到达肠系膜淋巴结和血液并被脾脏和肝脏的巨噬细胞吞噬，在肝脏和脾脏会形成多细胞的感染病灶，从而形成持续感染（mastroeni et al,2009），并持续刺激机体产生免疫应答。减毒的沙门氏菌，最终会被宿主清除。1.1.4 沙门氏菌的减毒由于沙门氏菌是人畜共患病原菌，野生型沙门氏菌会引起人和动物肠热症、胃肠炎、败血症等。因此应用其作为疫苗载体之前需要作减毒处理，减少病原菌对动物宿主的致病性。同时当其致病性大时，更容易激起身体的免疫反应，导致机体清除病菌，降低疫苗载体在肠道内生存的时间。减毒株感染宿主细胞后可在体内长期存活并诱导产生保护性免疫反应。早期减毒手段是利用化学物质诱变和紫外线照射，这两种手段具有很大的盲目性，且由于引起的往往是点突变，因此极易产生回复突变。随着对沙门氏菌毒力因子和免疫机理的深入了解以及dna重组技术的发展，在沙门氏菌染色体基因组上随机插入一个转座子或删除、突变一段或几段基因片段的减毒手段已广泛应用（姜娜，2009）;（徐引第，2006）。目前已研制出许多新的、遗传确定的、新型减毒株作为口服活疫苗的候选菌株，包括：营养缺陷型突变株（aroa、arocd 、pura）（hoiseth et al,1981）;（hone et al,1991）;（ocallaghan et al,1990），热休克蛋白酶缺陷株（htra）（johnson et al,1991），腺苷酸环化酶缺陷株（cya、crp）（curtiss et al,1996）;（curtiss et al,1987），毒力调控缺失株（ phop-q、dam、slya）（miller et al,1989）;（heithoff et al,1999）;（kaneko et al,2002）;（miller et al,1990）。 1.1.5 染色体-质粒平衡致死系统染色体-质粒平衡致死系统又叫载体-宿主平衡致死系统，其宿主菌由于管家基因的突变或缺失，导致细菌不能合成必需的营养物质，因而不能在基本培养基上生长，必须在添加相应营养物质后方可生长。当带有其管家基因的互补质粒导入缺陷型宿主菌后，载体-宿主构成遗传互补，缺陷型宿主菌可在无特殊营养物质添加的基本培养基上生长。由于宿主菌依赖互补质粒才能生长，一旦质粒丢失，细菌因不能合成必需的物质，不能在基本培养基上生长。应用营养选择标志，该系统无需使用抗生素标记即可使外源基因在宿主菌中稳定表达。传统的表达载体通常带有抗药基因，为了使质粒稳定遗传，必须使用抗生素作为选择压力。但是，按照美国fda 食品与药物管理机构( food and drg administration)的规定, 活疫苗中不能存在抗药质粒，且在人和动物体内，无法以抗生素来维持重组质粒的稳定性。因此，在活载体疫苗中使用染色体-质粒平衡致死系统携带和表达外源基因，更具安全性和稳定性。应用同源重组技术，科研人员己成功构建了伤寒沙门氏菌属的营养缺陷株，其中以asd基因和thya基因构建的平衡致死系统得到了广泛使用。asd基因负责编码天冬氨酸-半醛脱氢酶，是细菌的赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、二氨基庚二酸合成途径中的一种关键酶（galan et al,1990）;（schleifer et al,1972）。二氨基庚二酸（dap）是构成革兰氏阴性细菌细胞壁上的肽聚糖的基本成分，缺少dap将导致细胞的裂解和死亡。在基本培养基和动物体内无dap的存在，因此asd基因可用于构建染色体-质粒平衡致死系统。1988年，nakavama等建立了以asd基因为选择标志的染色体-质粒平衡致死系统。nakavama首先构建了asd基因缺失(asd)的s.typhimurium菌株，将表达asd基因的质粒转化至asd基因缺失（asd-）鼠伤寒沙门氏菌中，构成互补系统并能高效和稳定的表达外源基因（nakayama k,1988）;（ascon et al,1998）。thya基因编码胸腺嘧啶核苷酸（dtmp）合成酶(thymidylate synthase)，该酶是 dtmp 从头合成途径中的关键酶，催化dump向dtmp转化， thya 的缺失导致 dtmp 从头合成途径受阻。虽然dtmp可通过补救合成的方式由胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷合成，但是由于胸腺嘧啶类物质在原核、真核乃至人和动物的体液中含量甚微，故一般情况下，thya基因缺失会导致细菌 dna 合成受限死亡，只有在基本培养基中加入胸腺嘧啶或其核苷酸等成分，或者导入含有thya基因的质粒，其缺失株才可生长（belfort et al,1983）;（morona et al,1991）;（黄维等，2002）。 1.1.6 red重组系统同源重组是多种生物体内普遍存在的一种生理现象，由体内的同源重组酶介导完成。同源重组酶的作用机理不同于限制性内切酶，它不受内切酶位点限制，只要供体和受体dna分子间具有一段相同的碱基序列（即所谓的同源臂）两者就能发生重组或替换（王军平等，2005）。传统同源重组方法是利用 reca重组系统，应用该技术人们已经实现了多种形式的dna修饰（oconnor et al,1989）;（hamilton et al,1989）。但是以reca同源重组为基础的基因敲除需要较长的靶基因同源臂，且重组率很低，操作相对费时。大肠杆菌的噬菌体中存在一种有别于宿主的重组系统red系统。1998年，murphy应用该重组系统实现在大肠杆菌染色体上进行基因重组（murphy,1998）。该系统由噬菌体的exo、bet和gam 3个基因 (也称，和) 组成。exo基因编码外切核酸酶exo，exo蛋白能结合在双链dna的末端，降解双链dna的5 端链，产生3 端突出。bet基因的产物beta蛋白能结合至单链dna的3 突出端，防止dna被单链核酸酶降解，同时启动互补链间的退火反应。gam基因的产物gam蛋白能与宿主recbcd核酸外切酶相结合，从而抑制其对线形dna的外切酶活性（poteete,2001）。red重组系统由3种质粒构成：(1)同源重组辅助质粒，其提供协助同源重组的 exo、bet、gam 3个基因，用于表达重组系统的 3个蛋白；（2）抗性模板质粒，该质粒含有两侧带有翻转酶结合位点 ( flipase recognition target，frt )的抗性基因，用作抗性基因扩增模板；（3）抗性基因消除质粒，其表达的flp重组酶特异性地剪切frt位点，用于消除染色体上同源重组的抗性基因。datsenko等（datsenko et al,2000）将gam、bet、exo基因置于受阿拉伯糖诱导的parab启动子的控制下，构建了具有高效重组功能的低拷贝质粒pkd46，加入一定浓度的阿拉伯糖，诱导质粒pkd46表达出 exo、beta、gam三种蛋白质。pkd46含温度敏感型复制子，在高温条件下无法复制，重组完成后可升高宿主菌培养温度将 pkd46从菌株中消除，以便于进一步操作。pkd3是氯霉素抗性模板质粒。pcr扩增得到两侧带有同源臂和翻转酶结合位点 ( flipase recognition target，frt )的抗性基因片段，电转入经诱导表达的含有质粒pkd46的细菌中，在red重组酶的作用下，pcr片段借助两端与靶基因两翼同源的序列与染色体上对应区域发生重组，染色体上的靶基因被抗性基因所替代。pcp20是含温度敏感型复制子的抗性消除质粒，热诱导flp酶的合成，特异性识别抗性基因两端的frt位点，从而消除细菌染色体的抗性基因（cherepanov et al,1995）。重组示意图见图1.1（datsenko et al,2000）。图1.1 基因敲除原理图。h1和h2代表同源臂，p1和p2代表引物位点这种重组系统的优点在于其所需的同源序列只需3050bp，可以直接将同源臂设计在引物上，通过pcr产生的两端带有同源臂的dna片段即可用于同源重组。到目前为止，利用red重组系统在普通大肠杆菌中进行基因整合和敲除已经相当成熟。1.2 研究意义与目的鉴于临床多种耐药性菌株不断产生和迅速水平传播扩散，fda已禁止在重组菌生产中使用抗生素和含抗药性基因作为筛选标志的载体质粒。本实验目的在于构建染色体-质粒平衡致死系统以替代以抗生素作为筛选标记的载体表达系统，利用red重组技术，敲除沙门氏菌的asd基因，构建染色体-质粒平衡致死系统，使外源基因在没有抗生素压力的条件下稳定表达，从而增加沙门氏菌载体系统的稳定性和安全性，以作为目的基因表达的载体。1.3 研究内容1.利用red重组技术将沙门氏菌x4062的asd基因敲除。2.构建含asd基因的质粒pcla-egfp。3.将重组质粒pcla-egfp转入已被敲除asd基因的沙门氏菌x4062 asd中，于基础培养中培养，分析其表达蛋白。1.4 技术路线质粒pcl-egfpx4062基因组dna制备减毒鼠伤寒沙门氏菌x4062基因组dnapcrpcrpcrpcl-egfp片段扩增asd基因扩增天冬氨酸-半醛脱氢酶（asd）基因酶切、连接asd基因测序 质粒pcla-egfp设计同源重组引物筛选重组菌x4062 asd敲除asd基因去除氯霉素抗性基因氯霉素筛选重组菌x4062 asd:cat 转化x4062 asd蛋白表达分析2 材料与方法2.1 实验材料、试剂和仪器2.1.1 毒株、细胞、菌株及质粒从华南地区养殖场获得疑似口蹄疫猪水泡皮和水泡液；pk15细胞、减毒鼠伤寒沙门氏菌x4062、克隆菌株e.coli dh5由本实验室保存；red重组系统质粒pkd46、pkd3、pcp20由本实验室保存；质粒pegfp、pegfp-n1由本实验室保存。2.1.2 实验试剂pmd18-t vector、总rna提取试剂盒（minibest viral rna extraction kit 4.0)、反转录试剂盒（primescript ii 1st strand cdna synthesis kit）、rna酶抑制剂、ex taq酶、dna marker dl 2000、dna marker dl 5000、质粒快速提取试剂盒（minibest plasmid purification kit ver.2.0）、胶回收试剂盒（agarose gel dna fragment recovery kit ver.2.0 ）、dna纯化试剂盒（dna fragment purification kit ver.2.0 ）均购于宝生物工程（大连）有限公司。kod fx酶购于toyobo公司；核酸内切酶mlu i、bcl i、nhei、xho i、bamh i购于neb公司；kod-plus高保真dna聚合酶、t4 dna 连接酶均购于toyobo公司；二氨基庚二酸（diaminopimelic acid，dap）购自sigma公司；脂质体lipofectaminetm 2000购于invitrogen公司；l-阿拉伯糖和其他试剂均为分析纯，购自上海生工生物工程技术服务公司。2.1.3 培养基、试剂的配制（1）细菌培养lb培养液：0.5%酵母提取物、1.0%蛋白胨、1.0%nacl，用naoh调ph值至7.0，121 15min高压灭菌。lb固体培养基：lb培养液、1.2%琼脂粉，121 15 min高压灭菌。高渗培养基：0.5%酵母提取物，1.0%蛋白胨，10%蔗糖，121 15min高压灭菌。50mg/ml的dap溶液：称取500mg的dap，用10ml 1mol/ml的盐酸溶解，0.22um滤器过滤。1mol/l的l-阿拉伯糖溶液：称取1.5g的l-阿拉伯糖，溶于10ml的蒸馏水，0.22um滤器过滤。50mg/ml的氨苄青霉素溶液：称取500mg的氨苄青霉素，用于10ml的蒸馏水，0.22um滤器过滤。35mg/ml的氯霉素溶液：称取350mg的氯霉素，溶液10ml的无水乙醇。0.1mol/l的氯化钙溶液：称取10.1g的氯化钙固体，溶于1000 ml的蒸馏水，121 15min高压灭菌。0.1mol/l的氯化钙/15%甘油溶液：量取15ml的甘油，加0.1mol/l的氯化钙溶液定容至100ml，121 15min高压灭菌。10%的甘油溶液：量取10ml的甘油，加蒸馏水定容至100ml，121 15min高压灭菌。（3）tricine-sds相关试剂5样品缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/l的tris-hcl（ph6.8），5ml 50%甘油，2ml 10%的sds，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4保存数周，或在20保存数月；1%溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝定溶于10ml无水甲醇中。30%丙烯酰胺凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4保存，一般可放置3个月。注意：丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺均为神经毒剂，在称取过程中应该戴手套、口罩，在通风橱中进行；ph8.9分离胶缓冲液：tris 18.15g ，加1mol/l hcl 48ml，加重蒸水至80ml使其溶解，调ph8.9，定容至100ml，4保存；ph6.7浓缩胶缓冲液： tris 6.05g ，加1mol/l hcl 48ml，加重蒸水至80ml使其溶解，调ph6.7，定容至100ml， 4保存；temed（四乙基乙二胺）原液；10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）；ph8.3 tris-甘氨酸电极缓冲液：称取tris 30.3g，甘氨酸188g，10g sds，加蒸馏水约900ml，调ph8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4保存，临用前稀释10倍。考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝r250 1.0g，加入甲醇450ml，蒸馏水450ml，冰醋酸100ml，滤纸过滤；脱色液：用量筒取250ml 95%乙醇、80ml 冰乙酸，用双蒸水定容至1000ml；10% sds，100ml。称取10g的sds，加蒸馏水至总量100ml。室温保存；50tae电泳缓冲液：tris碱242 g、冰乙酸57.1 ml、0.5 mol/l edta 100 ml（ph8.0），加水至1000ml。2.1.4 仪器和器材pcr仪（eppendorf公司），电转仪（bio-rad公司），数字凝胶成像系统（美国alpha公司），co2培养箱（thermo公司），低温冷冻离心机（eppendorf），其它常规仪器等。2.2方法2.2. 减毒鼠伤寒沙门氏菌asd缺失株的构建2.2.1 菌株与质粒本研究中所用菌株和质粒详见表2.1。表2.1菌株和质粒菌株和质粒相关基因型和特性鼠伤寒沙门氏菌（x4062）实验室分离的弱毒株e.coli dh5asdasd-pkd46ampr, r101ts origin, parab promoterpkd3cmr，r origin，flp recombinase sitepcp20ampr/cmr, r101ts origin, flp recombinase2.2.2 引物设计本研究pcr扩增所用引物对见表2.2。表2.2 pcr扩增目的dna片段所用引物引物名称引物序列 (53)pcr产物asd-1-upctttccaactgctgagctga扩增asd上游同源臂asd-1-downgggcgaatagcgtcgaaatcasd-2-upgaacatggggccagagttct扩增asd下游同源臂asd-2-downtgggtctggtgcattccgagp1+c1tgttctcatgcaacgcatggtagaggagcgcgatttcgacgctattcgccctgtttgtgtaggctggagctgcttcg扩增同源重组片段asd55+catp2+c2ccataacaactggtcgcctacggtaaacgccgacaagaactctggccccatgttccatatgaatatcctccttag2.2.3 asd基因的制备参照genbank上发布的鼠伤寒沙门氏菌sl1344株（genbank: fq312003.1）的基因序列，于asd基因序列上下游设计引物asd-1-up和asd-2-down扩增asd基因，引物由invitrogen公司合成。引物序列见表2.2。减毒鼠伤寒沙门氏菌x4062培养物经离心、重悬和水浴煮沸法制备重组菌染色体dna模板。pcr反应使用toyobo公司的kod-plus高保真酶，在pcr反应管中加入下列反应体系：10pcr buffer5l25mm mgso4 2lasd-1-up 1.5lasd-2-down 1.5ldna模板 1lkod-plus dna聚合酶 1l去离子水 31ltotal50l将各反应物混合后，置pcr仪进行pcr扩增。程序：94 2min；94 15sec，56 30sec，68 2min，30个循环；68 10min。反应完毕后，取5l pcr反应液，进行1%琼脂糖电泳鉴定。将pcr产物按takara公司的dna fragment purification kit ver.2.0操作说明进行纯化，纯化后用ex taq聚合酶处理使其加上a末端，连接t载体，鉴定阳性菌落，提取质粒，命名为pmd-asd，质粒送invitrogen公司进行测序。2.2.4 含frt位点和cat基因的同源重组片段的制备和纯化（1）同源引物的设计同源重组片段由两部分组成：asd基因同源臂、frt位点和cat基因。同源臂用于位点专一性重组，frt位点和cat基因用于筛选重组子。不同的同源臂长度对重组效率有影响，实验设计55和500两个长度的同源臂。以pmd-asd和pkd3为模板，设计以下引物：引物p1-c1、p2-c2：分别由两部分组成，5端序列与 asd 基因两翼序列同源, 3端序列与质粒pkd3上cat基因两侧序列互补，pcr产物长度为1123bp，其中同源臂长度为55bp。引物asd-1-up、asd-1-down：用于扩增asd基因上游同源臂，长度为500bp。引物asd-2-up、asd-2-down：用于扩增asd基因下游同源臂，长度为500bp。（2）同源重组片段的制备同源重组片段asd55-cat的制备：以质粒pkd3为模板，p1-c1、p2-c2为引物，进行 pcr 扩增。以第1次pcr产物稀释溶液作为模板进行二次pcr，以消除模板质粒的影响，pcr产物标记为asd55-cat。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测、dna回收试剂盒纯化和 dna 浓度测定后，用于同源重组操作。pcr反应使用toyobo公司的kod-plus高保真酶。同源重组片段asd500-cat的制备： 以质粒pmd-asd为模板，asd-1-up、asd-1-down为引物，进行 pcr 扩增，扩增出长度为500bp的asd基因上游同源臂片段，标记为asd-1。以质粒pmd-asd为模板，asd-2-up、asd-2-down为引物，进行 pcr 扩增，扩增出长度为500bp的asd基因下游游同源臂片段，标记为asd-2。以asd55-cat、asd-1、asd-2为模板，asd-1-up、asd-2-down为引物，进行融合pcr，扩增出两端同源臂长度为500bp的同源重组片段，标记为asd500-cat。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测、dna回收试剂盒纯化和 dna 浓度测定后，用于同源重组操作。2.2.5 沙门氏菌电转感受态细胞的制备(1) 零下70冰箱取出冻存的细菌，在无抗生素抗性的琼脂板划线，37过夜培养。(2) 从新鲜的琼脂板上挑取一个沙门氏菌单菌落，接种于含5ml lb培养液的锥形瓶中，于37摇动（250r/min的摇床）培养，过夜。(3) 接种1 ml的过夜培养物到盛有100 ml预热lb培养基的锥形瓶中，于37摇动（200r/min）培养，每隔20min测量一次od600值。(4) 当od600值达到0.4时，迅速将培养物置于冰浴中1530min，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。(5) 将细菌转移至冰冷的离心管中，4 5500r/min离心3 min，以回收细胞。倒去培养液，用50 ml 冰冷的纯水重悬沉淀。(6) 4 5500r/min离心3 min，以回收细胞。倒去培养液，用25ml 冰冷的10%的甘油重悬沉淀。(7) 4 5500r/min离心3 min，以回收细胞。小心弃去上清液，吸掉残留的液体。加10ml的冰冷的10%的甘油重悬沉淀。(8) 4 5500r/min离心3 min，以回收细胞。小心弃去上清液，吸掉残留的液体。加3ml的冰冷的10%的甘油重悬沉淀。细胞的浓度应该在131010 个细胞/ml（1.0 od600= 2.51010 个细胞/ml）。(9) 将悬液按40l/份分装到冷却的无菌离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。置零下70备用。(10) 需要用冻存的电转化感受态细胞时，从零下70冰箱中取出适当的份数，室温下待融解后将管转移至冰上。2.2.6 重组酶质粒pkd46的转化和诱导表达(1) 将2l的pkd46质粒加入沙门氏菌电转感受态细胞中，混匀后加入冰预冷的电转杯中。同时阴性对照。(2) 调节电击仪，使电脉冲为25 uf，电压2.5 kv，电阻200欧姆。(3) 擦干电转杯外的冷凝水，将电转杯放进电击仪。(4) 按上述设定的参数，启动对细菌的电脉冲。(5) 脉冲结束后，尽可能快地加入700l 37预热的lb培养基，菌液转移到ep管后，置30在轻柔震荡下培养1h。(6) 取不同体积的电击转化细胞，铺于含有50g/ml氨苄青霉素的lb琼脂板。(7) 倒置培养板于30培养，转化克隆在1216 h内出现。(8) 挑取单菌落，在含50g/ml氨苄青霉素的lb中30过夜培养。(9) 接种1 ml的过夜培养物到盛有100 ml预热lb培养基的锥形瓶中，于30摇动（200r/min）培养，每隔20min测量一次od600值。(10) 当od600值达到0.3时，加入l-阿拉伯糖至终浓度为30 mmol/l，诱导1 h。(11) 制备电转感受态细胞2.2.7 asd基因的敲除(1) 将10l的含frt位点和cat基因的同源重组片段加入含质粒pkd46并经l-阿拉伯糖诱导表达的感受态细胞中，混匀后加入冰预冷的电转杯中。同时阴性对照。(2) 调节电击仪，使电脉冲为25 uf，电压2.5 kv，电阻200欧姆。(3) 擦干电转杯外的冷凝水，将电转杯放进电击仪。(4) 按上述设定的参数，启动对细菌的电脉冲。(5) 脉冲结束后，尽可能快地加入700l含50g/ml dap的lb培养基，菌液转移到ep管后，置30在轻柔震荡下培养1h。(6) 取不同体积的电击转化细胞，铺于在含有50g/ml dap 和25g/ml氯霉素的 lb 平板上筛选单个菌落。(7) 倒置培养板于37培养，重组菌应在1216 h内出现。2.2.8 沙门氏菌asd:cat的鉴定将重组菌接种含25g/ml氯霉素和50g/ml dap的lb液体中42培养，使pkd46质粒丢失。取细菌培养物经离心、重悬沉淀和水浴煮沸法制备重组菌染色体dna 模板，以p1+c1和p2+c2引物pcr 检测重组菌，琼脂糖凝胶电泳检测 pcr 扩增产物。阳性重组菌命名为x4062 asd:cat。2.2.9 氯霉素抗性基因的去除(1) 制备重组菌x4062 asd:cat 的电转感受态细胞。(2) 将编码 flp 点特异性重组酶的 pcp20 质粒dna 转化到x4062 asd:cat，涂布在含50g/ml氨苄青霉素和50g/ml dap 的lb 平板上，30 培养。(3) 接种菌落于lb培养基，42 培养数小时。(4) 菌液分别于amp抗性、cm 抗性和无抗生素抗性的平板划线，进行 amp 和 cm 抗性检测，获得对上述两种抗生素均敏感而 dap 依赖的阳性克隆，命名为x4062 asd。(5) 进一步制备该重组菌基因组 dna 模板，以asd-1-up和asd-2-down为引物进行 pcr 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测 pcr 产物。(6) pcr 产物经纯化回收，与pmd-18t 载体连接，转化 dh5，涂布含 amp的 lb 平板，筛选阳性克隆，将阳性克隆酶切鉴定后送ivitrogen公司测序。2.3 含egfp的双启动子互补表达载体pcla-egfp的构建2.3.1 表达载体pcla-egfp的构建策略在pcl-egfp载体的基础上，将抗性基因替换成asd基因，构建能与asd缺陷株互补的平衡质粒pcla-egfp，以增加质粒的稳定性，提高减毒沙门氏菌携带的外源抗原在体内的免疫应答反应。测定pcla-egfp载体在减毒鼠伤寒沙门氏菌x4062中的稳定性，并鉴定该双启动子表达载体的蛋白表达活性，对以减毒鼠伤寒沙门氏菌为疫苗载体的应用作出新的探索。载体构建策略如图2.1。2.3. 载体构建所用引物构建互补载体pcla-egfp所用引物见表2.3。表2.3 载体pcla-egfp的构建所用引物引物名称引物序列 (53)pcr产物pcmvlac-upattacgcgtacgtcggggcggcagpcl-egfp片段pcmvlac-downgcctgatcaacaatttacgccttaagbcli-asd-mlui-upgcctgatcagcacatctctttgcagasd基因片段bcli-asd-mlui-downaatacgcgtttacgccaactggcgcpcmv ie plac bcl i mlu i puc ori egfp sv40 polya pcl-egfp 片段 asd 基因 asd bcl i mlu i pcla-egfp sv40 polya not i egfp kpn i pcmv plac puc ori asd pcl-egfp ecor i kanr /neor sv40 polya puc ori egfp pcmv not i kpn i plac pcr 酶切、连接 图2.1 pcla-egfp载体构建策略2.3.3 重组质粒pcla-egfp的构建（1）引物的设计将pcl-egfp载体上的抗性基因替换成asd基因，构建能与asd缺陷株互补的平衡质粒pcla-egfp。以质粒pcl-egfp为模板，设计引物pcl-egfp-up、pcl-egfp-down扩增包含puc ori、pcmv、plac、egfp、sv40 polya 的载体片段，并在两端添加mlu i和bcl i酶切位点（图2.2）。以质粒pmd-asd为模板，设计引物bcli-asd-mlui-down、bcli-asd-mlui-up，扩增包含asd核糖体结合位点和asd编码序列的片段，并在两端添加bcl i和mlu i 酶切位点（图2.3）。pcmv ie plac bcl i mlu i puc ori egfp sv40 polya pcl-egfp 片段 图2.2 pcl-egfp片段 asd 基因 asd bcl i mlu i 图2.3 asd基因（2）pcl-egfp片段的扩增在pcr反应管中加入下列反应体系：10pcr buffer 5l25mm mgso4 2lpcmvlac-up 1.5lpcmvlac-down 1.5lpcl-egfp质粒 1lkod-plus dna聚合酶 1l去离子水 31ltotal50l将各反应物混合后，置pcr仪进行pcr扩增。程序：94 2min；98 15sec，56 30sec，68 3min，30个循环；68 10min。反应完毕后，取5l pcr反应液，进行1%琼脂糖电泳鉴定。将pcr产物按takara公司的dna fragment pur