盐酸贝尼地平对大鼠硝酸甘油耐受性的影响及机制

【摘要】 目的 观察盐酸贝尼地平对硝酸甘油（NTG）耐受性的影响及其机制。方法 通 过描记大鼠舒张反应性曲线，测出各种 NTG 浓度时舒张反应百分率，检测血管组织中的 丙二醛(MDA)含量、一氧化氮（NO）含量、一氧化氮合酶（NOS）活性和环磷酸鸟苷 (cGMP)含量。结果 通过对照 NTG+盐酸贝尼地平组和 NTG 组发现，盐酸贝尼地平可以显 著减少 MDA 含量（7.831.41）比（14.370.88) mol/g 蛋白，P0.05 。结论 盐酸贝尼地平可以通过抗氧化作用，减少氧自由基的产 生，使 NTG 源 NO 灭活减少和组织中 NO 含量增加；增加 cGMP 含量和活性，从而恢复 NO 信号传递系统完整性。 【关键词】 硝酸甘油； 钙通道阻滞药； 超氧化物类 The effect of benidipine on nitroglycerin tolerance in rats SHEN Deliang*, LIU Hengliang, ZHAO Youmin, LIANG Hongxia, CHENG Liangxing. *Zhengzhou Peoples Hospital, Zhengzhou 450002, China Corresponding author: LIU Hengliang, Email: 【Abstract】 Objective To investigate the effect of benidipine hydrochloride (dihydropyridine calcium channel blocker, CCB) on nitroglycerin (NTG) tolerance in rats and to study the mechanism. Methods Thoracic aorta of rat was used. Maximal relaxation response curve was drawn and malondialdehyde (MDA) level, nitric oxide synthase (NOS) activity and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) level were measured. Results Benidipine hydrochloride could decrease the inactivation of NTG by its antioxidation effects including increase of vascular cGMP level, activation of NOS and increase of NO level which could ameliorate the NO signal transduction system. Conclusion Benidipine hydrochloride can ameliorate NTG tolerance by several antioxidation mechanisms. 【Key words】 Nitroglycerin; Calcium channel blockers; Superoxides 1867 年 Brunton1发现在治疗心绞痛时，如果长期使用硝酸甘油（NTG）必须增加 剂量才能维持其疗效，相继有很多学者在临床上利用超声和监测血压等手段同样发现持续 使用 NTG 其作用大大减弱，这个现象就是后来称为的“NTG 耐受” 2 。但是对于那些心 血管危重症患者来说，需要采用持续用 NTG 的方法，这样就使得临床医生不得不面对这 个问题。二氢吡啶类钙离子拮抗剂，在心血管内科是一种常用的药物，其中盐酸贝尼地平 对血管内皮的保护功能和逆转内皮功能的作用成为心血管治疗领域中的一个新的研究方向。 理论上盐酸贝尼地平能够通过多种途径改善或阻止 NTG 的耐受性。 1 对象和方法 1.1 研究对象 选取雄性 SD 大鼠 32 只，体质量 300350 g，由河南省实验动物中心提供；盐酸贝尼 地平由华夏药业有限公司提供；NTG 贴剂(16 mg/片)由 Zhuhai Schwarz Pharma 公司提供； 丙二醛(MDA)试剂盒、一氧化氮（NO）试剂盒、一氧化氮合酶（NOS）试剂盒和环磷酸鸟 苷(cGMP)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；125I环磷酸鸟苷(125IcGMP)放射免 疫试剂盒购自上海中医药大学同位素室。 1.2 实验动物分组 用雄性 SD 大鼠 32 只，随机分为 4 个小组。(1)正常对照组(C 组，n=8)：不给予任何 药物。(2)盐酸贝尼地平组(B 组，n=8)：盐酸贝尼地平 6 mg/kg 用 23 ml 生理盐水稀释灌 胃。(3)NTG 组（n=8）：建立 NTG 耐受大鼠模型。于处死前三天开始，把 NTG 贴剂(0.05 mg/h)贴于皮肤表面。(4)NTG+B 组(n=8)：用盐酸贝尼地平 6 mg/kg 的 23 ml 生理盐水灌 胃。于处死前三天开始，把 NTG 贴剂(0.05 mg/h)贴于皮肤表面。实验时间为两周。 1.3 实验方法 1.3.1 主动脉环对不同浓度 NTG 的舒张反应程度测定 锤击大鼠后脑处死并且迅速 开胸摘取大鼠的胸主动脉，放置于 0的 Krebs 缓冲液中，轻柔修整并将其切割成 35 mm 的血管环，悬挂于盛有 37 Krebs 缓冲液的生理浴槽中，保持 37恒温并且持续通 入 95%(体积分数)O2 和 5%(体积分数)CO2，用细不锈钢丝将血管环挂在浴槽底部并连接张 力换能器上，张力换能器通过放大器与台式二道生理记录仪连接，调节基础张力至 1 g，平 衡 4560 min。 先向 Krebs 液加入浓度为 10-6mol/L 去甲肾上腺素使血管环预收缩，待收缩达到平 台期后再依次将累积浓度的 NTG(10-910-4mol/L)加入循环的 Krebs 液中，由台式二道 生理记录仪描记血管环舒张曲线。实验中在观察下一浓度药物前血管环张力持续不变稳定 10 min。将浓度为 10-6mol/L 去甲肾上腺素预收缩前的血管环舒张程度定为 100%，预收缩 后的舒张程度定为 0，按此标准计算滴加某一种药物浓度后血管环舒张反应的百分率。 1.3.2 大鼠主动脉组织 MDA 含量、NOS 活性、NO 含量和 cGMP 含量的测定 (1) MDA 含量：取 10%的大鼠主动脉组织匀浆液 0.2 ml 加于测定管，0.1 ml 标准品加入标准管， 0.1 ml 甲醇加入空白管，4.1 ml 甲液（试剂盒提供）各加入标准管、空白管及测定管，混 匀器混匀，置沸水浴 40 min，3000 r/min，离心 10 min，吸取上清液，蒸馏水调零，532 nm 处比色，测定吸光度（A）值，计算样品中 MDA 含量，单位为 nmol/mg 蛋白。 （2） NOS 的测定：取 50 l 双蒸水于空白管中，50 l 组织匀浆于测定管中，150 l 反应液依 次加入上述两管，混匀，37 水浴反应 15 min，终止液:1.0 ml，540 nm 波长，0.5 cm 比色 杯，空白管调零，测定 A 值，计算 NOS 的活性，单位为 U/mg 蛋白。(3)NO 测定：取 0.1 ml 双蒸水于空白管中，0.1 ml KNO3 标准液于标准管中，0.1 ml 匀浆样品液于样品管中， 试剂（试剂盒提供）：加试剂 0.1 ml，试剂 0.1 ml，混匀，37 60 min，试 剂 0.5 ml，试剂 0.5 ml，置室温 10 min，530 nm 波长，0.5 cm 比色杯，空白管调零， 测定样品管和标准管 A 值，计算 NO 的含量，单位为 mmol/g 蛋白。(4)cGMP 含量测定： 50 mg 主动脉组织放入盛有 2 ml 冷的 50 mmol/L 醋酸缓冲液的 pH 4.75 试管内(放入冰浴)， 用匀浆器将组织粉碎后的悬浮液放入 10 ml 试管内，用 2 ml 无水乙醇洗匀浆器然后将乙醇 倒入悬浮液内混匀静止 5 min，3500 r/min 离心 15 min，将上清液收集在青霉素小瓶内，再 用 75%乙醇 1 ml 洗匀浆器两次，用该 2 ml 75%乙醇洗沉淀混匀 3500 r/min 离心 15 min。取 上清液收在青霉素小瓶内，在 60 烤箱里烤干备用。按 125I RIA 试剂盒说明操作。各级 标品得标准曲线，由样品管中测值从标准曲线中查相应的数值，单位为 pmol/g。 2 结果 2.1 大鼠离体主动脉环对 NTG 舒张血管作用的反应性及血管组织中 MDA 含量、 NOS 活性、NO 含量和 cGMP 含量 不同浓度效应反应曲线(图 1):NTG 组浓度效应反应曲线比其他 3 组明显右移。 NTG+B 组浓度效应反应曲线比 C 组和 B 组明显右移。C 组和 B 组浓度效应反应曲线 无明显偏移。 与 C 组比较，aP0.05)。 注：与 C 组和 B 组比较，aP0.05)，C 组与 B 组之 间差异无统计学意义(P0.05)。 2.2.3 主动脉组织匀浆中 NO 含量的变化 见表 1:NTG 组和 NTG+B 组含量显著高于 C 组和 B 组，NTG+B 组高于 NTG 组(P0.05)。 2.2.4 主动脉组织匀浆中 cGMP 含量的变化 见表 1:NTG 组 cGMP 含量显著低于 C 组和 B 组和 NTG+B 组，其他 3 组间差异无统计学意义(P0.05)。 3 讨论 NTG 在治疗缺血性心脏病和充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)等心血管疾 病具有相当重要的地位。但是大量的动物和人体试验都发现如果长期使用 NTG 会发生耐 受现象34 。在本实验中，通过大鼠离体主动脉环对不同浓度 NTG 舒张血管作用的反 应性这个指标56证明大鼠主动脉发生了 NTG 耐受。 NTG 的活性代谢产物是 NO7 ，NO 通过信号传递，即激活血管平滑肌细胞上的可 溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanyl cyclase,sGC)，从而增加组织中第二信使 cGMP 含量， cGMP 又使 cGMP 依赖性蛋白激酶(cGMPdependent protein kinase,cGK)的表达增加， cGK直接调节细胞中 Ca2+水平和相关蛋白的磷酸化水平，使血管平滑肌松弛，血管扩 张8 。NO 的合成主要受 NOS 活性、底物和辅助因子可用度、酶亚基聚合成活性二倍体 的程度等因素影响。 在 NTG 耐受性的研究中，大量的实验结果证明了血管紧张素、内皮素 1 和去甲肾 上腺素水平的升高，他们除了可以通过自身的缩血管作用和产生 O2-的途径9抵抗 NTG 的舒张血管的作用外，还可以通过细胞内第一信使 IP3 增加细胞内 Ca2+水平，从而 增加了磷酸二酯酶 1A1 的活性。我们知道机体内 O2-等主要通过过氧化作用使细胞膜磷脂 分子中不饱和脂肪酸的过氧化，生成脂质过氧化物，再经过氧化物酶分解生成 MDA，最 终使磷脂结构发生变化，生物膜功能发生异常变化。因此，通过测定脂质过氧化产物 MDA 的变化，可间接反映体内氧化应激状况，它是体内氧化应激状态的有效指标。 盐酸贝尼地平为二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂，能选择的抑制 L 型钙离子通道，作用 时间长，所以它本身就有扩张血管的作用，而且具有良好的选择性10 。本实验中大鼠离 体主动脉环对 NTG 舒张血管作用的反应性结果表明，NTG+B 组显著高于 NTG 组，但是 仍然比 C 组和 B 组要低。而 B 组的各种观察指标与 C 组大鼠比较差异无统计学意义，这 表明盐酸贝尼地平在改善 NTG 耐受时，其本身扩张血管的作用并不是主要因素，这可能 与本实验观察的是离体血管有关。本实验结果显示，NTG+B 组 NOS 活性较 NTG 组并未 显著升高，而 NTG 组和 NTG+B 组血管组织中 MDA 含量较其他两组明显增加，并且 NTG+B 组又显著高于 NTG 组，表明在持续应用 NTG 和 NTG 联合使用盐酸贝尼地平时都 可以导致血管组织中的 NO 含量升高，NTG 组增加的 NO 很可能是 NTG 源的 NO，不过 O2-使它的活性下降，其中 NOS 无作用。应用盐酸贝尼地平可以通过它的抗氧化作用减少 O2-的生成，阻滞 O2-引起的 NO 活性下降，从而改善血管的舒张反应程度。盐酸贝尼地平 可能通过激活内皮型一氧化氮合酶（eNOS） ，增加组织中 NO 的含量，改善 NTG 耐受。另 外我们注意到大鼠的血管组织中的 cGMP 在 NTG+B 组明显高于 NTG 组。有实验指出 cGMP 水平是反映 NO 含量的指标，NO 水平升高，cGMP 水平也应该相应的升高。通过本 试验可以看出 cGMP 并非完全是 NO 增加的一个被动的结果。盐酸贝尼地平这种新型二氢 吡啶类钙离子拮抗剂可能通过自身的抗交感神经分泌去甲肾上腺素和阻滞钙离子通道，减 少细胞内 Ca2+水平，在舒张血管的同时还能够降低 Ca2+导致的 PDE1A1 的激活，减少 cGMP 的水解，这都对 NTG 耐受的改善起到相当的作用。 虽然通过我们的实验可以证明盐酸贝尼地平可以通过多种渠道改善 NTG 耐受，显著 地降低了 NTG 耐受程度，但是仍然没有使大鼠离体主动脉环对 NTG 的反应性完全纠正， 这也表明 NTG 耐受是一个非常复杂的过程，还有待于继续深入研究。 参考文献： 1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮 158 例疗效观察J;广东医学;1997 年 10 期 2 董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮 126 例J;中国中医药科技;1999 年 06 期 3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会J;江西中医药;/xyfm/class/.2002 年 05 期 4 张随学 ,谭正辉 ,孙叶梅 ,李梅 ,俞玉芳 ,韩峰;3003 例痤疮患者特征分析与控制对策J; 中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002 年 06 期 5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗J;临床医药实践杂志;2003 年 09 期 6 高宜云;痤疮从肝论治J;中医药临床杂志;2004 年 03 期 7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮J;中华皮肤科杂志;2004 年 09 期 8 陈五一;痤疮辨治体会J;世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007 年 03 期 9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效J;新中医;/book/main/index.php.1992 年 09 期 10 李东华;异维生素 A 酸治疗痤疮J;新医学 http: