还原糖蛋白质脂肪的鉴定

【 实验四 】 生物组织中 还原糖、脂肪、蛋白质 的鉴定 1 1实验目的 1 学会本实验的准备 2 练习并熟练掌握鉴定生物组织中可溶 性糖、脂肪、蛋白质的基本方法。 3 学会教学生进行实验探究。 4弄清实验过程中应注意事项，易出现 的问题及解决方法。 2 实验原理： 某些化学试剂能够使生物组织中的有关有机 化合物产生特定的颜色反应 如：糖中的还原糖与斐林试剂发生作用可以 生成砖红色沉淀；蛋白质与双缩脲试剂发生 作用产生紫色反应；脂肪可以被苏丹 染液 染成橘黄色。 因此，可以根据与某些化学试剂所产生的颜 色反应来鉴定生物组织中糖、蛋白质和脂肪 的存在 3 还原糖的鉴定原理 生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有 葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基 或游离酮基），因此叫做还原糖。蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟 基，因此叫做非还原性糖，不具有还原性。本实验中，用斐林试剂只 能检验生物组织中还原糖存在与否，而不能鉴定非还原性糖。 斐林试剂由质量浓度为 0.1 g mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为 0.05 g mL的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的 Cu(OH)2沉淀。 Cu(OH)2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成 砖红色的 Cu2O沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。其反应式如下 ： CH2OH (CHOH)4 CHO 2Cu(OH)2CH2OH (CHOH)4 COOH Cu2O 2H2O 用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色棕色砖红 色 (沉淀 )。 鉴定可溶性还原性糖的另一种方法：多伦试剂法。多伦试剂即硝酸银 氨水溶液，配制方法：取 0.3ml2硝酸银溶液，滴入 10氢氧化钠溶 液，再滴入 2氨水溶液，边滴边摇动试管，直到生成的沉淀恰好溶解 ，即得到澄清的硝酸银氨水溶液。现用现配。 4 蛋白质的鉴定原理 鉴定生物组织中是否含有 蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲 试剂。双缩脲试剂的成分是质量浓度为 0.1 g mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为 0.01 g mL的硫酸铜溶液。在碱性溶液 (NaOH)中， 双缩脲 (H2NOC NH CONH2)能与 Cu2+作 用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应 叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很 多与双缩脲结构相似的肽键，因此，蛋白质 可与双缩脲试剂发生颜色反应。 5 供选材料 ： l 可溶性还原性糖的鉴定：苹果含果糖较高，实 验效果也很明显，且容易在市场上买到。但要注意， 苹果组织液必须临时制备，切勿保存时间过长。因为 苹果多酚氧化酶含量较高，组织液很容易被氧化成褐 色，将反应产生的颜色覆盖。温度高时，氧化的速度 更快。而梨和白心萝卜的组织液不会有这种现象出现 。 l 蛋白质的鉴定：鸡蛋清：蒸馏水 =1:9混合均匀 ，再用 4层纱布过虑，放入滴瓶中备用，这样配制的 蛋清溶液与双缩脲试剂反应后不会粘固在试管内壁上 ，反应也彻底，试管也容易洗刷干净。 也可以用浓豆浆代替蛋清溶液 6 器材 显微镜、双面刀片、试管、试管夹、大 烧杯、酒精灯、三脚架、石棉网、试管 架、载玻片、吸水纸、电炉。 7 试剂配制： 斐林试剂 甲液 氢氧化钠的质量浓度 0.1g/ml的溶液 乙液 硫酸铜的质量浓度 0.05g/ml的溶液 使用时临时配制，将 4滴 5滴乙液滴入 2ml甲液中，配完立即使用。 与斐林试剂原理一样的本尼迪试剂配制后可长久保存，配方如下：无水硫酸铜 1.74g溶于 100ml热水中冷却后加至 150ml。取柠檬酸钠 173g，无水碳酸钠 100g和 600ml水共热，溶 解后冷却并加水至 850ml。再将冷却的 150ml硫酸铜溶液倾入即可。 苏丹 III溶液的配制 称取 0.1g苏丹 III或 IV干粉，溶于 50ml丙酮中，再加入 70酒精 50ml即可使用。 苏丹 溶液的配制 称取 0.1 g苏丹 干粉，溶于 50 mL丙酮中，再加入体积分数为 70%的 酒精 50 mL，充分混合后即可使用。 双缩脲试剂的配制： 取 10g氢氧化钠放入量筒中，加水至 100ml，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成氢氧化钠的 质量浓度为 0.1g/ml的溶液，瓶口上塞上胶塞，贴上标签：试剂 A 取 1g硫酸铜放入量筒中，加水至 100ml，待充分溶解后倒入试剂瓶中，配成硫酸铜的质量 浓度为 0.01g/ml的溶液（蓝色），瓶口上塞上胶塞，贴上标签：试剂 B 8 方法及步骤： 一、还原糖的鉴定 1.制备生物组织样液 （ 1）将洗净苹果切成小块。（ 2）取几小 块（ 5g）放入研钵中，加少许石英砂研磨， 再加 5ml水，继续研磨。（ 3）将玻璃漏斗插 入试管中，在漏斗上垫一层纱布，将研磨液 过滤。 2.实验操作方法和观察 9 （ 1）取一支试管，向试管内注入 2ml苹 果组织液（ 2）向试管内注入 2ml刚配制 的斐林试剂。振荡试管，使溶液混合均 匀，此时溶液呈蓝色。（ 3）将这支试 管放进盛有开水的大烧杯中，用酒精灯 加热煮沸 2分钟左右。在对试管加热煮 沸的过程中，随时仔细观察试管中溶液 的颜色发生了什么变化。 10 二、蛋白质的鉴定 1. 制备蛋白质稀释液（实验教师准备） 2. 实验操作方法和观察 （ 1）取二支试管，向一只试管内注入 2ml蛋白质稀释液。 （ 2）向试管内加入 2ml双缩脲试剂 A（质量浓度为 0.1g/ml 的 NaOH溶液），摇荡均匀。注意观察试管内溶液的颜色 有什么变化。（ 3）再向试管内加入 3-4滴双缩脲试剂 B（质 量浓度为 0.01g/ml的硫酸铜溶液），摇荡均匀。注意观察 试管内溶液的颜色有什么变化。 3、 结论：蛋清组织液与双缩脲试剂发生作用后，产生了 （ ）色反应，这说明蛋清组织液中含有（ ） 4、 另一支试管内装入蛋清组织液的作用是（ ） 11 三、脂肪的鉴定： 1、 取一粒浸泡 34小时的花生种子，去皮后纵切下一些薄片（注意刀片不要 划伤手指） 2、 用毛笔将最薄的一片移到洁净的载玻片的正中央 3、 向花生薄片上滴 23滴苏丹 染液，染色 23分钟后用吸水纸吸去薄片周 围的染液（染色的时间一定把握好） 4、 在薄片上滴 12滴 50%的酒精以洗去浮色，用吸水纸吸去周围的酒精 5、 在薄片上滴 12滴蒸馏水，盖上盖玻片（盖玻片不要平放，应倾斜一定的 角度下放，以免产生气泡，若有气泡，可在一边滴蒸馏水另一边用吸水纸 吸水至无气泡止） 6、 用低倍镜寻找装片的最薄处（ 12层）并将这部分移到视野的正中央，观 察已着色的圆形小颗粒。 7、 换用高倍镜观察（注意：在使用显微镜的过程中显微镜一定要平放不可 倾斜） 8、 结论：苏丹 染液与花生子叶细胞内圆形小颗发生了（ ）色 反应，这说明花生种子内含有（ 12 鉴定脂肪的实验中，用刀片将花生子叶削下 很薄的一片，放在载玻片上然后滴加 1 2滴 5 乙醇，乙醇是脂溶性溶剂。可将花生细胞 中的脂肪颗粒溶解成油滴，浸 5分钟后，用吸 水纸将切片周围乙醇吸去，然后滴加 0.2苏 丹 III染液（比 0.1浓度的效果更佳）。由于 油滴加大了折光率，与染液作用后就形成红 色透亮的油滴，效果很好。但是不易久放。 13 检测生物组织中的糖类、脂肪 和蛋白质的实验的改进 一、 原实验的不足 但原实验不但需要苹果、花生和鸡蛋三种比较难加工的实验材料，且 实验内容多，时间长，容易导致学生做实验很匆忙或者实验效果不理 想，从而打击学生的信心。并让学生没有时间去考虑实验是为了什么 ，从实际上剥夺了学生的质疑权力，违背了我们设定实验的初衷。具 体不足如下： 1、需要水浴加热 2分钟。如果教师不提前准备好热水加温过程更长。 2、没有对照实验，没有对照怎么能证明水浴加热后的砖红色沉淀就是 还原糖还原而成，为什么不可能是 Cu(OH)2自身分解产生的呢？ 3、脂肪鉴定实验中，显微镜的操作、子叶切片都需要很长时间。特别 是对于才进高中的学生而言，要求所有的学生都能熟练运用徒手切片 技术也不现实。 4、在学生对生物染色剂的染色特性了解不深的情况下，很难指出显微 镜下哪些黄色或红色的东西就是脂肪。 14 二、 实验的改进之处 由于原实验存在以上不足，我首先选用生活中常见且操作起来 很方便的液态状的牛奶，来替换书上的苹果、花生和鸡蛋三类 实验材料，大大节省了实验的时间与消耗，体现实验的科学性 与实用性，除此之外还对实验进行了以下改进： 1、减少实验器材的使用，从而简化实验过程。如：不使用水浴 加热、不使用显微镜等。 2、改进实验方法，节省时间与试剂。如：糖的鉴定中，使用两 只试管同时直接加热法，实验只需几滴斐林试剂，且反应也只 有约 30秒，这样既节省了时间与试剂，而且起到了很明显的对 照作用。 3、改验证实验为探究实验。如：给予食用油与水，用苏丹 染 色观察现象。 15 探究实验的具体过程如下： 3 1、 给予实验任务 现有一瓶 “牛奶 ”，请学生用实验来探究牛奶 中是否含有说明书中所说的糖、蛋白质、脂 肪三类成份。 3 2还原性糖实验 3 2 1实验原理：牛奶中的乳糖是一种醛 糖（由葡萄糖 +半乳糖构成），能还原斐林试 剂（ 0.1% NaOH,5% CuSO4）中的 Cu2+产 生砖红色 Cu20沉淀。 16 3 2 2实验过程 取 2块试管，编号水、牛奶； 滴加 4滴斐林试剂 A液，再滴加 4滴斐 林试剂 B液，摇匀； 再分滴加 7滴水、牛奶摇匀； 同时用两个试管夹夹着在酒精灯上均 匀加热 30秒； 观察并记录现象（牛奶显现砖红色） 。 17 3 3蛋白质实验 3 3 1实验原理：牛奶中富含酶、磷蛋白等蛋白质 ，其中肽链中的 -CO-NH-能在 NaOH溶液中与 CuS04 稀溶液（ 1%）产生紫色，因而证明蛋白质存在。 3 3 2实验过程 取 2支试管，编号。分别注入约 1/8试管水、牛奶； 再分别注入 1/8试管双缩脲试剂 A，摇匀； 再分别向试管中加入 34滴双缩脲试剂 B液，摇匀 ； 观察并记录现象。（牛奶显现紫色） 18 3 5脂肪实验 3 4 1实验原理：牛奶中的奶油和 维生素 D等是含量丰富的脂类物质，它 们可被苏丹 染液染成橘红色颗粒。 19 20 3 4 2实验过程 取过滤纸一片，等距编号：水、食用油、 牛奶； 分别滴加 2滴水、食用油、牛奶于相应处； 分别滴加 1滴苏丹 于 3处，染色 3分钟； 观察并记录现象（水显红色；食用油、牛 奶显橘黄色）。 结论：奶粉中确实存在还原糖、蛋白质、脂 肪。 21 改进后由于实验时间充足，可以继续拓 展实验 ,比如讲解婴儿长期食用劣质奶 粉因营养不良造成水肿而出现大头症状 ，再展示安徽阜阳劣质奶粉导致的大头 娃娃事件，然后让学生从劣质奶粉的组 成上探究劣质奶粉到底是缺什么造成大 头娃娃的想象。还可以让学生自己探究 生活中感兴趣想探究的材料。 22 经过以上改进实验，不仅使学生学习了 实验的原理与方法，更重要的是打破了 学生认识过程中的思维定势，培养了学 生的探究能力。同