ELISA检测技术ppt课件

酶联免疫吸附试验 (ELISA) ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用 1 酶联免疫吸附试验（ ELISA） 酶联免疫吸附试验 ( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原 -抗体反应的 特异性 和 等比例性 ，是酶免疫测定技 术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附 （ 包被 ）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表 面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液 相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生 颜色反应 ，通 过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，通过颜色反应 的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。 2 ELISA的发展概况 自从 Engvall和 Perlman（瑞典， 1971）首次报道建立酶联免 疫吸附试验（ ELISA）以来，由于 ELISA技术具有快速、敏感 、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了 ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的 ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检 测方法之一。 目前， ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫 、环境监测等诸多领域广泛应用。 3 ELISA的基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗 体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可 与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶 液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成 有色的氧化型，出现 颜色反应 。因此， 可通过底物的颜色反应来 判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或 抗原的量呈正比 。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定 ，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起 来，使 ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 基本原理 4 ELISA试剂盒的组成 完整的 ELISA试剂盒通常包含以下各组分： （ 1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称 酶标板 ）； （ 2） 酶 标记的抗原或抗体（ 酶标记物 ）； （ 3）酶的 底物 ； （ 4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液； （ 5）酶标记物及样本的稀释液； （ 6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）； （ 7）反应终止液； （ 8）封口膜若干、说明书一份。 5 酶标板 6 ELISA常用酶类 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP) DH2+ H2O2 D + H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 常用底物 ： 1. 邻苯二胺 (OPD)，产物为 橙红色 （ 492nm检测 ）； 2. 四甲基联苯胺 (TMB)，产物为 蓝色 ，酸性条件下变为 黄色 （ 450nm检测 ）。 反应终止液： HCl或 H2SO4溶液。 7 碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP) 常用底物 ： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为 黄色的对硝基酚 （ 405nm检测）； 2. 发荧光底物（磷酸 4-甲基伞酮），可用于荧光测定， 灵敏度高于显色底物的方法。 反应终止液： NaOH 溶液。 8 ELISA所需仪器设备 恒温箱 洗板机 酶标仪 9 ELISA的类型和方法 半定量 ELISA试验 定量 ELISA试验试验目的 试验性质 间接法 双抗夹心法 (直接夹心法 ) BAS-ELISA 双夹心法 (间接夹心法 ) 竞争法 ELISA 直接法 10 直接法 ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上 的抗体或抗原结合形成酶标抗原 -抗体复合物，加入酶反应底物 ，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量 （见后图） 。 该方法可用于检测抗体或抗原。 直接法 ELISA 优点 : 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。 缺点 : 1. 应用范围较小，生产难度大。 需制备各种酶标抗原或抗体。 11 间接法 ELISA 间接法 ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原 -抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。 该方法可用于抗体检测 ， 是目前检测抗体最常用的 ELISA方 法。 优点 : 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体 ; 2. 制备方便，价格便宜。 12 双抗夹心法 ELISA 双抗夹心法 是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获 抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合 物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量 ，本方法也称为 直接夹心法 （见后图） 。 该方法可用于抗原检测， 例如细胞因子、激素、蛋白质、细 菌、病毒等， 是目前检测抗原最常用的 ELISA方法。 优点 : 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便，价格便宜。 13 双夹心法 ELISA 双夹心法 是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗 原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体 -抗原 -未标记抗体 复合物；再应用酶标二抗和抗体 -抗原 -未标记抗体复合物结合， 形成抗体 -抗原 -未标记抗体 -酶标二抗复合物，也称为 间接夹心法 （见后图）。 该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。 优点 : 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。 缺点 : 实验操作较复杂。 14 15 BAS-ELISA BAS-ELISA即生物素 -亲和素系统（ biotin avidin system, BAS） ELISA法： 是先将抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原， 然后用生物素（ biotin）标记的抗体与抗原反应形成抗体 -抗原 -生 物素标记抗体复合物，再依次加入亲和素、酶标记生物素（或直 接加入酶标记的亲和素），最后加底物显色。 生物素 是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶 R或维生素 H。 亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合 4个生物素分子 。因此， 本方法 具有信号放大功能（特点） 。 该方法可用于抗原、抗体以及 DNA和 RNA（生物素）检测 。 16 BAS-ELISA实验原理 17 竞争法 ELISA 竞争法 ELISA的实验原理 ：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在 对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原） ；在 测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原）， 酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原 -抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。 18 测 定孔 E E E EE 酶标记物 底物溶液 对照孔 E EEEEE E EEEEE E EE 酶标记物 底物溶液 参 考液 (不含抗原 ) E E 样 本 (含抗原 ) 竞争法 ELISA实验原理 19 半定量 ELISA试验 20 间接法检测血清 HBsAb含量 设计加板次序 (空孔、阴、阳 ) 加板 (阴、阳、样 ) 37 , 30min 加酶标抗体 (空孔除外 ) 洗涤 3次，拍干 加底物溶液 (空孔除外 ) 37 , 10-30min 加终止液 (空孔除外 ) 避光 上机检测、结果判定 (空孔调零 ) 37 , 30min 洗涤 3次，拍干 21 双抗夹心法检测血清 IL-2含量 设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准 ) 加板 (阴、阳、标准、样 ) 37 , 30min 加酶标抗体 (空孔除外 ) 洗涤 3次 , 拍干 加底物溶液 (空孔除外 ) 37 , 10-30min 加终止液 (空孔除外 ) 避光 上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零 ) 从标准曲线上 读取样品含量37 , 30min 洗涤 3次 , 拍干 22 ELISA试验中的注意事项 必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 半定量（或定性） ELISA中结果判断依据通常为： OD样 /OD阴 2.1时为阳性结果， 2.1时为阴性 ； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性； 定量 ELISA中