基因治疗血友病

血友病的基因治疗概述 血友病分为遗传性血友病和获得性血友病。前者是一组先天性单基因遗传 性凝血因子(F)、IX(FIX)或者(F)缺乏而导致的凝血功能障碍的出血性 疾病，而后者一般同时缺乏 2 种或者多种凝血因子，常继发于肝炎、肝硬化、 肝癌转移等肝脏疾病，某些血液病(如急慢性白血病)、淋巴瘤、系统性红斑狼 疮、类风湿性关节炎和尿毒症等。我们主要就就遗传性血友病(简称血友病)的 基因治疗作一综述。 1 血友病的机理及传统治疗方法 血友病特点为早年发病，轻微外伤或小手术后的持续反复甚至自发出血，多有 家族史并多发于男性。根据凝血因子所缺乏的种类可以分为血友病 A(F缺乏)、 血友病 B(FIX 缺乏)和血友病 C(F缺乏)，血友病 A 约占血友病的 85，血友 病 C 在临床上比较罕见，血友病 A、B 均为 X 染色体隐性遗传，而血友病 C 则为 常染色体不完全隐性遗传。血友病的基础研究(包括血友病相关凝血因子的 SNP、STS、STR 等多态性位点)已经比较成熟，其基因突变有着高度的异质性， 包括基因缺失、异常基因片段的插入、基因片段的重排和点突变等。对于小片 段的缺失、插入和点突变来说，血友病的严重程度取决于该突变所在结构域的 功能，但也有极少数血友病患者编码区及其旁侧序列并未发生突变。在 F等 凝血因子的转运过程中，许多蛋白质也参与其活性、非活性形式转换的调控， 编码这些蛋白质基因的突变也会引起血友病样症状的出现。 随着发病率较高的疾病得到越来越好的诊治，以前被人们认为发病率较低的血 友病，因其严重威胁着血友病患者的生活质量而越来越受到重视。目前血友病 的传统疗法主要有替代疗法(对症补充血浆制剂和凝血因子浓缩制剂)、重组凝 血因子疗法3和预防疗法等。替代疗法中患者会产生相应凝血因子的抑制物而 抵消 3O甚至更多的凝血因子活性，且存在传播病毒的危险。针对传统的浓缩 或高纯凝血因子所产生的抑制物，临床上有采用猪 F浓缩制剂来解决，因为 猪 F与抑制物的亲和力比人 F要高的多；另外，绕过内源性凝血途径利用 F旁路制剂(凝血酶原复合物(PCC)和激活的凝血酶原复合物(APCC)也可以促 凝；目前有 1 种新的旁路制剂，即重组活化的 F(ra)，由于它的酶促反应 局限在细胞表面，所以大大降低了全身凝血活化和血栓并发症等副反应，其高 效性和安全性已得到认可；但是高昂的治疗费用及副作用，使猪源性 F及 rFa 的应用均大打折扣4，通过基因工程方法生产的重组凝血因子虽然减少 了传播病毒的危险，可也存在一些副反应(第 1、2 代制品)和理论上的危险5。 预防疗法则主要是针对降低血友病发病率、提高患者生活质量而采取的措施。 此外，中医药在血友病治疗上也取得了一定的进展，北京椿树医院血友病治疗 中,6E 报告了他们对 424 例血友病(A 型、B 型)患者采用中药治疗的情况，结果 比较乐观，但相关的项目监测还有待进一步证明。以上疗法均需终身治疗且收 费昂贵，因此血友病被形象地称为“贵族病”。基于传统治疗的缺点，2O 世纪 中末期兴起的基因治疗在血友病治疗领域的研究备受关注。 2 血友病基因治疗 基因治疗是一种以改变基因表达为基础的治疗与预防遗传性疾病和多因素疾病 的方法，它通过基因工程的实验手段，将正常基因(包括调控序列)导入基因缺 陷的患者体内，使导入的基因发挥作用或使缺陷基因在原位得以校正和修复， 从而纠正基因缺陷导致的各项异常表现。自 1979 年被首次运用于疾病治疗研究 以来，基因治疗经过了准备期(19801989 年)、狂热期(19901995 年)和理性 期(1996 年至今)3 个阶段7，这其问，因其所引发的毒副反应以及生殖细胞水 平的基因治疗所涉及的一些伦理问题，曾一度处于停滞状态。国内自薛京伦等 8 于 1991 年首次开展血友病基因治疗以来，血友病的基因治疗受到了广泛关 注，并于 2O 世纪末期有了长足进展。 血友病所以成为基因治疗研究的首选在于：1)血友病系单基因造成的凝血紊乱， 基因水平上的发病机制已较为清楚，如 F基因突变的相关数据库已建立 (http：wwwfactorxiorg)。较之以前在血友病相关凝血因子基因、 蛋白结构及其功能上的研究，近年来有不少学者致力于研究患者血小板聚集率 以及 F基因表达的调控9。2)正常血浆中凝血因子的含量很少(gmg)L， 并且约正常凝血因子浓度的 1O 就可以维持正常凝血，而对于 F缺乏患者来说， 1一 5 就能维持正常凝血1。3)凝血因子在血浆中的水平没有很严格的调控， 凝血因子在正常人群中的范围跨度较大，F、FIX 的正常上限可达 150。4)除 肝脏能产生凝血因子外，其它一些器官也能产生，靶器官的可选择范围较宽。5)凝 血因子的相关基因已经克隆分离。6)构造动物模型时可选用体型较大的动物(如 狗)，与人体环境较为相近。腺病毒载体于上世纪 9O 年代开始应用于人体内的 基因治疗，在以小鼠、狗和猴子等动物为模型的实验中，均成功地表达了凝血 因子并纠正了凝血紊乱的表型，这都显示出血友病基因的希望。随着载体在基 因治疗中的重要性被人们所认识，载体的开发和改造也进一步深入和拓展，尤 其是重组腺病毒的使用，使血友病的基因治疗有了可喜的前景 Il。迄今为止， 虽然尚无 1 项动物实验得到凝血因子终生持续表达的阳性结果，但长达几年的 表达效果已显示出其巨大的潜在价值。1994 年的首次临床实验方案采用了逆转 录病毒载体途径；1995 年则以人皮肤角质细胞为靶细胞，以鼠科白血病病毒为 载体，将 FIX 的 cDNA 转入角质细胞中进行培养，结果外源基因稳定地整合到了 角质细胞的染色体上。目前国际上关于血友病基因治疗的临床实验正在如火如 荼地展开，GenStar 公司研制的 MAxADF腺病毒载体由 1 种普通的感冒病毒 改造而成，该载体中所有与递呈病毒相关的基因都被编码 F的基因所替代， 目前 MAX-ADF已进入临床试验阶段 Il。Avigen 生物技术公司用于治疗血友病 B 的 CoagulinB(TM)基因疗法通过肌内注射给药，临床试验进展良好，并已申 请新药调查。我国在此研究领域起步较早，薛京伦等 Il。在国内首先开展了 血友病 B 基因治疗研究，以皮肤成纤维细胞等为靶细胞，采用逆转录病毒、腺 病毒及其相关病毒等介导的基因转移方法，作了人 FIX 的离体表达、动物试验 和安全性检测等一系列研究，并早在 1993 年就进行了血友病 B 成纤维细胞的临 床 I 期基因治疗试验，该课题组研制的 AAV2 一 hFIX 注射液已经获得国家食品 药品监督管理局的药物 I 期临床研究批文，标志着我国血友病基因治疗已获得 突破性进展。 3 血友病基因治疗的影响因素及对策 目前影响基因治疗效果的主要因素包括载体引起的免疫反应、载体的安全性和 外源基因不能持续高效表达等，解决的途径主要是选择合适的载体类型、适宜 的载体剂量、载体进入宿主的途径以及特异性的靶器官等，除此之外，治疗时 机的把握、患者情况的确认以及细胞因子对转入基因启动子的影响等也应考虑 在内。 31 载体的类型主要分为病毒载体和非病毒载体，目前应用较多的是病毒载体。 每种载体都有不同的应用对象，并且各有其优缺点。一般来说，AAV 病毒2和 逆转录病毒所引发的副反应要弱些，而腺病毒载体则较强2，但也有研究显示， 由逆转录病毒介导的基因治疗所诱发的致癌风险远比预期的要高；此外，所引 发免疫反应的强弱与质粒 DNA 中 GpC 模块的含量及其甲基化程度也有关。如何 改造载体值得高度重视，目前主要是改变病毒载体的衣壳结构，修饰或尽可能 削减病毒的编码基因。有研究用血清型为 2568 的 AAv-cF载体对血友 病小鼠和狗进行基因治疗，经过长时间的观察后发现，以血友病 A 小鼠和狗为 动物模型，分别应用血清型为 68 和 268 的 AAVcF为载体，均持续表 达了治疗活性水平的 F，并且在长达 3 年的时间内没有检测到抗体或其它相 关的毒性。目前一些特异性细胞靶向载体、新病毒或非病毒载体的开发正在有 条不紊地开展。Essner 等认为沉默的转座子可能成为以染色体为靶目标的非病 毒载体，并且已有一系列针对血友病和 I 型糖尿病等疾病的试验结果表明转座 子系统确实效果良好，相关研究现主要集中在靶位点的选择和插入后突变的形 成等方面，它可能成为比病毒载体更安全可靠的另一种基因治疗途径。关于腺 病毒依赖性辅助病毒的研究结果也比较乐观，这种病毒几乎缺失所有的病毒编 码顺序，只产生很小的免疫反应以及几乎可以忽略的副反应 l_2。Moayeri 等 。利用逆转录病毒载体使造血干细胞表达转入的 F，并待诱导免疫耐受 后将造血干细胞移植人小鼠体内，在实验的 6 个月中凝血因子持续表达(正常血 浆的 11)，并只检测到极少量的 F抗体。 32 载体的剂量及进入宿主的途径不管是通过自体(直接体内)还是回体(间接 体内)途径进入宿主，诱导产生免疫反应的细胞因子取决于载体的剂量。通过肝 脏途径向小鼠体内注射大剂量的 AAV 一载体会引发对转入基因表达产物的耐 受，通过肌肉注射则会产生 FIX 抗体，而使用低剂量的载体可避免对 AAV 病毒 衣壳产生的特异性体液免疫反应，此外，转入基因的表达水平也可能影响免疫 耐受。有研究对狗和大鼠通过骨骼肌注射包装有凝血因子 FIX 的 AAVs，结果 FIX 的表达持续稳定，且未检测到 FIX 抗体，免疫反应较弱，这可能与其诱导 产生 TGFB 和其它组分的 CD4T 细胞有关3。也有研究将整合有外源基因的细 胞装入经磁化处理的铁磁流体藻酸盐微胶囊中，分别输给患有血友病等疾病的 小鼠，结果证明这种基因治疗方法效果较好，再通过核磁共振成像(MRI)对小鼠 体内微胶囊进行追踪和尸解，发现微胶囊具有良好的渗透性和生物适应性，这 为人类基因治疗中免疫隔离方法的应用提供了有利的依据32。另外，Cao 等 I33 研制了预防免疫反应的草案：预先在血友病 B 小鼠的鼻腔内，用含人 FIX 特异的 CD4T 细胞抗原决定簇反复处理，同时在将小鼠的 FIX 基因敲除后，利用 腺病毒介导转人人 FIX 至肝脏，即可诱导产生人 FIX 的 IgG。结果显示经鼻腔 处理的小鼠，其产生的抑制物大为减少，且体内 FIX 水平较恒定，基因敲除小 鼠的部分凝血紊乱也得到持续纠正，这种免疫偏差是由 IL-10 和 TGF-的升高、 CD4CD25T 细胞调控机制的激活引发了 T 辅助细胞的一系列反应而造成的。 33 靶(细胞)器官的选择目前血友病基因治疗的靶细胞主要是皮肤成纤维细胞 和肝细胞。有研究对 2 条患血友病 B 狗的静脉注射辅助依赖性腺病毒载体(携带 含 FIX 开放读框基因)，注射后 2 条狗的凝血时间从60min 下降到20min，并 且在没有明显抑制剂产生的情况下分别持续了 604 和 446d，这是此种载体在较 大型动物上首次实现的长时间的表型纠正，虽然有几项实验指标异常，但尚未 发现毒副作用。 34 基因治疗的时机基因治疗的时机对疗效的影响目前尚未达成共识。Xu 等 35的 1 项研究以新出生的血友病 A 小鼠和狗为模型动物，用与治疗无关的序 列逆转录病毒为载体(如敲除了基因的 B 结构域等)作基因治疗，结果检测到 动物体内血浆 F：C 达到了正常动物(13922)和(116 士 5)的活性值，且保持 了 15 年；凝血试验结果正常且未发现抑制因子，说明新出生的小鼠和狗所接 触到的相关危险因素较少，因而存在的影响抑制因素也较少，新生儿期也应是 基因治疗的适宜时机；对新生儿肝脏的基因治疗的研究结果显示，治疗后新生 儿能持续分泌 F，且治疗相关免疫副反应大为减少，这使得动物试验结果在 人体试验的水平上得到了进一步的支持。另 1 项在母亲妊娠后期对基因缺陷确 诊胎儿基因治疗的研究表明，该治疗的器官靶向性很强，这是在婴儿、青少年 或成年时期的治疗所不能比拟的，该实验利用超声导向将包装有牛乳糖报告基 因和 F的腺病毒载体，从脐静脉进人胎儿的胎肝，随后转人的基因表达产物 通过 PCR、PT-PCR 免疫组织化学法检出 Es6。但是也有人认为在胎儿期进行基 因干预，会避免一些早发型的严重表征出现。对此，Coutelle 等3用 2 年时 间以小鼠为模型动物对胎儿血友病 B 作了基因治疗，发现小鼠在出生后都显示 了较好的治疗效果，然而伴随着治疗却产生了发生率很高的肝癌并发症。这为 基因治疗越早越好的观点提出了一个较有力的反证。 35 患者的情况患者暴露于危险因素的早晚会影响血友病的轻重程度，研究表 明如果宿主在早期就感染过野生型 AAV 或 AV，那么应用相关载体的基因治疗所 引发的免疫反应会更强烈 l3。当在小鼠中转人包装有人类基因的载体时，小鼠 所产生的免疫反应因其遗传背景而异3。此外，1 项 AV-LacZ 载体介导的由上 皮细胞转导的实验表明 IFN 一y、IL-IO 会下调启动子的活性，而 TFN-AIL-I 和 IL-4 会上调启动子的活性，因此细胞因子对转人基因启动子的影响也不可忽 视。 4 展望 虽然肿瘤等发病率较高的疾病在目前是基因治疗研究的热点。但是基因治疗作 为肿瘤治疗的手段之一尚不成熟，将血友病这种有典型意义的疾病作为模式是 开启基因治疗这扇大门的金钥匙。科学正确地了解血友病的分子和细胞学病因， 以及导致出血表型的致病机理是基因治疗的基本前提，再加上近些年对凝血因 子的基础研究日臻完善。血友病的基因治疗也更加有的放矢。基因治疗在血友 病方面的研究也会为凝血因子活性升高等其它凝血