动物病毒细胞增殖的研究进展

动物病毒细胞增殖的研究进展 目前，细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛。病毒和宿主细胞共同决定病毒适应细 胞生长并增殖。病毒首先通过特定的受体吸附于宿主细胞膜上，与受体结合后，进入宿主 细胞内进行基因组的复制。期间，病毒成功感染细胞除了需要病毒与受体结合，还依赖于 膜融合、内吞、囊泡运输及核定位信号介导入核等多个过程。细胞通过特异的病毒一受体 相互作用来识别病毒，这些受体决定了细胞对病毒的敏感性。尽管流感病毒、狂犬病毒、 口蹄疫病毒等能够成功的使用细胞培养，但是很多病毒的宿主范围很窄，病毒甚至无法进 行细胞培养。本文通过以下方法：宿主细胞的选择、细胞连续传代、改变细胞培养条件、 添加病毒保护剂、改变细胞结构，对动物病毒适应细胞培养增殖研究进行概述。 1 合适的宿主细胞 病毒适应细胞的能力与病毒自然宿主、病毒原发器官和细胞类型有关。例如，鸭肝炎 病毒不能感染哺乳动物单层细胞；水貂流行性腹泻冠状病毒仅在貂肺细胞培养繁殖；马传 染性贫血病毒常用马胚肾细胞系培养。SARS 病毒注射到鸡、火鸡、鹅、鸭和鹌鹑胚的尿囊 腔中病毒不复制，不引起病变。 猪伪狂犬病毒虽然具有广泛的嗜性，能在多种细胞内繁殖，但敏感度不同，其中以兔 肾细胞和猪肾细胞(原代和传代细胞系)最适于病毒的增殖，在 PK15(猪源)、Vem(猴源)、 BHK(鼠源)、CEF(鸡源)细胞中，该病毒在 PK15 上增殖速度最快。 Coria 等用鸡传染性支气管炎病毒 Beaudene 株接种猫、狗、绵羊、鹅等 14 种非宿主 动物肾细胞发现，培养的病毒滴度要远远低于接种鸡胚肾细胞的病毒滴度。其中，在猫、 狗、猪的肾细胞内采用直接荧光抗体方法检测不到病毒。Lukert 等通过比较在鸡胚、原代 鸡胚肾细胞、肝细胞上感染鸡传染性支气管炎病毒的增殖情况发现，病毒在鸡胚上的敏感 度最高，是肾细胞的 1240 倍，肝细胞的 5001000 倍。鸡气管环上皮细胞对该病毒更敏 感、更容易适应，鸡传染性支气管炎病毒肾变型分离株能够较容易的适应鸡胚肾细胞。这 些也提示我们，选择病毒原发宿主细胞培养病毒更容易成功并获得较高的病毒含量。 2 连续在细胞上传代 不同种类病毒，甚至同种病毒不同株在细胞上的适应及增殖能力均不相同。具体传代 次数通常与病毒和细胞种类有关。细胞类型和相应的细胞受体决定病毒是否能够感染细胞。 如果细胞上表达有病毒能够识别的相应受体，病毒易侵染细胞并繁殖释放子代病毒。如天 花疫苗 Dryvax 株经 MRC25 人胚肺二倍体细胞传至 5 代，肾综合征出血热病毒沙鼠肾细胞适 应株在 Vero 细胞传至 34 代病毒即可稳定增殖。但是，如果细胞缺乏病毒能够识别的受 体，病毒无法在细胞上适应、繁殖。通过增加病毒在细胞上的传代次数，在少量突变产生 的选择作用和突变产生的重组作用下，会使病毒逐渐适应细胞，病毒滴度逐渐提高。如狂 犬病毒在 vero 细胞上需要培养 17 代以上，猪细小病毒在 ST 细胞上培养 30 代，猪流行性 腹泻病毒在 Vero 细胞上传至 25 代以后，病毒才逐渐适应细胞，病毒增殖趋于稳定。这种 连续传代对病毒和细胞起着选择性压力作用，通过细胞传代培养，人们筛选出适应细胞生 长的病毒。 3 分步适应 病毒适应细胞存在“阶段性”适应特点。初次分离的野毒株通常难以在细胞上培养生 长。如果将初次分离的鸡传染性法氏囊病病毒直接接种鸡胚细胞，病毒很难适应，不能产 生明显的细胞病变。若将该病毒在鸡胚上连续传代后，再接种鸡胚细胞，则较易适应鸡胚 细胞培养。将鸡传染性法氏囊病病毒 B87 株鸡胚成纤维细胞适应毒在 Vero 细胞连续传 4 代 后，出现稳定的细胞病变。同样，人工分离培养鸡传染性支气管炎病毒，需要先使病毒适 应鸡胚、再适应鸡胚原代细胞、最后适应传代细胞。鸡传染性支气管炎病毒分离株在鸡胚 上传代次数较低(7 代)时很难在鸡胚肾细胞上增殖，而在鸡胚上适应 14 代后再接种鸡胚肾 细胞，仅传 3 代后可见细胞病变。Coria 等报道鸡传染性支气管炎病毒适应鸡胚后很难直 接适应 Vero 细胞，若病毒适应鸡胚肾细胞后，在 Vero 细胞上生长的可能性大大提高。 Cunningham 等通过将鸡传染性支气管炎病毒在鼠脑进行适应性传代，之后接种 Vero 细胞 传代，病毒在 Vero 细胞上获得适应。已适应鸡胚肾细胞的鸡传染性支气管炎病毒，在 Marc145 细胞上传至 10 代，可观察到明显的细胞病变。 4 病毒培养条件 在病毒适应细胞的培养过程中，对培养条件的要求也各不相同。例如培养温度、细胞 培养液的 pH 值，甚至病毒接种细胞的方式。 接毒后细胞培养液的 pH 值和培养温度是影响病毒增殖的主要因素。在有囊膜的病毒中， 病毒的囊膜与细胞膜发生膜融合之后，病毒侵入细胞。这种膜融合需要在特定的 pH 值、温 度条件下受体诱发病毒囊膜蛋白构象发生不可逆的改变，从而使病毒获得进入宿主细胞的 能力。例如，在 pH 中性或偏碱的条件下，有利于鼠、牛冠状病毒和鸡传染性支气管炎病毒 与细胞发生膜融合。而流感病毒、HIV 需要在低 pH 值下与细胞发生膜融合，进而侵入宿主 细胞。近来，Akxander 等发现，虽然鸡传染性支气管炎病毒在碱性条件下释放病毒粒子的 速度快，但是病毒滴度下降也快。而在酸性条件下，病毒粒子释放的慢，但是病毒滴度高， 病毒增殖稳定。Chu 等试验发现，在 pH5.0 的条件下，病毒与细胞发生膜融合的速度更快， 更适于鸡传染性支气管炎病毒的 S 蛋白与细胞膜上受体结合。 大多数动物病毒在细胞上的培养温度为 37左右。但是，张立等发现鸡传染性法氏囊 病病毒在鸡胚细胞上培养的最适温度是 39，更接近自然宿主鸡的温度40。即使同 种病毒不同毒株最适培养温度也会不同。如 A 型流感病毒是 37，而 B 型是 33 。在 4的低温下，通常病毒很难侵染细胞，如口蹄疫病毒在 2仅吸附猪肾细胞，但不发生病 毒感染。低温条件下病毒不侵染细胞与病毒侵染细胞辅助性酶的活性受到抑制有关。 通常大多数病毒采用异步接毒，即细胞生长成单层以后再接毒。但是，在某些情况下， 病毒同步接毒方法效果要优于异步接毒。例如，Vero 细胞培养狂犬病毒采用了细胞和病毒 同时传代、接种。此时接种，病毒与细胞成悬浮状态，互相接触的表面积大，使病毒通过 更多的空间受体进入细胞；从细胞生长代谢考虑，新鲜的细胞处于对数增殖期，细胞不断 吸收能量和养分，不仅供自身生长，也供给依赖其生存的病毒，促进其增殖。猪细小病毒 的增殖需要利用细胞 S 期的 DNA 聚合酶，确保细胞感染与病毒复制同步，使单位细胞病毒 产量在较短时间内达到最大，因此在接种 ST 细胞传代最好采用同步接毒方式。 5 病毒保护剂 目前，报道较多的病毒保护剂是在轮状病毒、流感病毒、仙台病毒、呼肠孤病毒、冠 状病毒培养过程中添加胰酶。人们早期用 Vero 细胞尝试培养流感病毒并不成功，后来 Govorkova 等发现在无血清培养基中加入 TPCK 处理的胰酶，在 Vero 细胞上培养 20 代，病 毒滴度达到 108.37TCID50/mL。因为流感病毒滴度与病毒 HA 血凝素糖蛋白的裂解有关。胰酶 能够将病毒颗粒非裂解型的 HA。变成裂解型的 HA1+HA2，提高了流感病毒在细胞中的复制 能力。在 A 型流感病毒对鸡胚细胞感染力低的情况下，加入胰酶可以显著提高病毒的感染 力。而对于感染力较高的病毒，添加胰酶提高病毒感染效果的作用并不明显。因为在低致 病力病毒株中全是未裂解的 HA，而高致病力毒株中 HA 全部或部分已经发生裂解。此外， 添加胰酶还能促进病毒多循环复制。以低感染复数病毒接种 Vero 细胞即可获得高产出的病 毒。同时，鉴于 Vero 细胞能迅速降解外源胰酶、在 37胰酶活性下降导致流感病毒的复 制受阻的情况，要在不影响细胞正常生长的情况下，逐步、不断地添加胰酶。 刘长明等报道称添加 D-氨基葡萄糖可显著增强猪圆环病毒的增殖能力，经过这种生化 试剂的处理，有可能提高了宿主细胞 S 期合成的聚合酶量或延长了聚合酶的合成时间。 Wang 等发现添加精氨酸能促进伪狂犬病毒(PRV)在鼠胸腺激酶缺陷细胞株(L-MTK)上增殖。 此外，一定量的精氨酸对腺病毒在人口腔上皮癌细胞上增殖、单纯疱疹病毒在兔肾细胞 RKl3 上增殖均有促进作用。 6 宿主细胞基因结构 病毒某些氨基酸的改变影响病毒与细胞之间的结合程度。鸡传染性支气管炎病毒 Beaudette 株在从鸡胚适应到 Vero 细胞生长的过程中，有 49 个氨基酸发生变异。证明突 变产生重组使毒株由鸡胚繁殖适应在 Vero 细胞上生长。Madu 等推断 Beaudene 株在细胞连 续传代过程中，病毒获得了与硫酸乙酰肝素(一种细胞受体)结合的能力，有助于感染非自 身宿主细胞。由此，人们尝试通过化学诱变剂改变细胞的基因组结构，提高病毒在细胞上 的适应性。Smith 等报道通过一种实验室的模式致癌物，单功能烷化剂 N-甲基-N-硝基-N- 亚硝基胍(MNNG)，处理鸡胚细胞得到的 PBS-l 细胞，能够快速分离到 A 型和 B 型流感病毒， 经短时间培养即可获得高滴度的病毒，效果优于鸡胚和 Vero 细胞培养方式。 基因工程技术的发展，使人为干预细胞原有代谢途径或引入新的代谢途径成为可能。 如将谷氨酸转移酶基因转入杂交瘤细胞 KB-26.5，使细胞能够在无谷氨酰胺的培养基中生 长，培养基检测不到对细胞有害的物质氨。将 TB/C3 细胞稳定转染抗凋亡基因 bcl-2，细 胞活力增强，寿命延长，抗体滴度上升。上述研究结果表明，将表达病毒特定受体的基因 转染到细胞中，促进病毒在细胞上适应、增殖成为可能。 迄今为止，许多病毒仍未适应或根本