傅里叶变换红外光谱诊断地中海贫血症 3

傅里叶变换红外光谱诊断地中海贫血症 【摘要】 为建立简单快速的地中海贫血诊断方法，本研究探讨了以傅里叶变换红外 光谱结合水平衰减全反射（FTIRHATR ）技术在地中海贫血诊断中的制样方法 及光谱的数据处理方法。在制样预处理中，通过对样品进行稀释并干燥成膜消 除水分子对光谱吸收干扰，保持 ATR 光谱中各波长对样品的穿透深度一致。结 果表明，当1652 cm吸收度小于1.5时（即透射率 T 小于4%时） ，各波峰强度 与血红蛋白浓度呈良好的线性关系（r0.995）及实验重复性（RSD0.995) and reproducibility (RSD4%) under 1.5 absorbance unit at 1652 cm. Modified intensity ratios method was used in 8001780 cm and 24803600 cm regions respectively. It demonstrated protein secondary structure change near 1638 cm and others significant differences such as bands at 1172 cm and 1440 cm that distribute to lipid, band at 1064 cm arising from phosphate substance and 2553 cm that originating from SH stretching vibration. This method not only avoids the problems of large number of free parameters comparison with other data processing but also can demonstrate differences of structure and composing in samples at total pattern. Keywords Fourier transform infrared spectroscopy， horizontal atlenuated total reflectance， thalassemias， intensity ratios 本文系国家自然科学基金（No.30660063）和广西科学基金（No.0575027） 资助项目 * Email: 1 引 言 随着光谱技术的发展，傅里叶变换红外光谱 (FTIR)已广泛应用于生物复杂 体系的研究1, 2。因为具有实时、快速、无损检测等特点， FTIR 已成为医 学中富有潜力的诊断工具之一，对癌症3,4、白血病5、血糖6等疾病的诊 断已有众多成功的应用。但由于生物样品中存在大量水分子，在中红外区对谱 图有着较强的干扰。在透射法中，通常将样品均匀分布于晶体表面干燥成膜， 以减少水分对样品检测所带来的干扰。为确保一次透射产生适合的吸收强度， 需要提高样品浓度或剂量，但会给样品制样带来诸多问题，如膜的厚度增加， 干燥处理时间会相对延长，样品大小、形状对光谱的吸收影响增强，导致光谱 的质量与重现性下降。水平衰减全反射 (horizontal attenuated total reflectance, HATR)技术的应用在一定程度上克服了以上因素所带来的问题。 与 FTIR 透射法不同，该技术中光束并非直接透射样品，而在晶体内进行多次全 反射，通过在反射点所产生的隐失波穿透样品产生红外吸收光谱（如图1） 。在 溶液中，由于某一固定波长所产生隐失波的穿透深度一致（均为微米级） ，一方 面可确保其吸收与样品浓度的线性关系，另一方面可减少水的强吸收，从而避 免了在透射法中需通过严格控制样品厚度而带来的繁琐操作，使检测方法更为 简单快捷7,8。此外，由于多点吸收，HATR 对微量样品的灵敏度更高，可降 低对样品浓度或剂量的需求，实现对超薄样品及微量样品的检测。 作者曾以微流控结合光镊拉曼光谱技术检测了地中海贫血症9。本研究仍 以地中海贫血作为研究对象，探讨了 HATR 用于地中海贫血诊断的定性与定量方 法。通过与透射法的比较，HATR 谱中灵敏性与重复性得以改善，其吸收强度与 样品浓度呈良好的线性关系。将一种改进的相对强度数据处理方法用于分析群 体水平上的组间差异。与常规的差谱法、二阶导数法相比，该处理方法对差异 识别敏感，直观的实验结果进一步提高了对地中海贫血的诊断机理的认识，简 单量化数据为光谱诊断提供可靠的指标。 2 实验部分 2.1 仪器与样本 傅里叶红外光谱仪(Nicolet 5700，DTGS/B 检测器) 配合 HATR 智能附件 (Thermo)。 经过确诊的健康个体血样（68份）和 重型地中海贫血患者血样（37份） ，由广西医科大学提供。考虑性别与年龄因素，样品中男女比例保持一致，两 组年龄相当。 2.2 实验方法 2.2.1 样本前处理及光谱检测 取200 L 外周血置于 1.5 mL eppendorf 离心管，4 、400 g 离心10 min 去上层清液，400 L Hanks缓冲液洗涤3次，400 L 蒸馏水低渗处理释 放红细胞内含物。4 、 20,000 g 离心 30 min 取上层清液，可置于20 作长期保存。血红蛋白溶液5 L 稀释液均匀涂布于 ZnSe 晶体表面(50 mm5 mm)，在干燥条件下成膜。分辩率为4 cm，扫描范围为8004000 cm， 扫描64次获得样品光谱。以透射法的制样方法，参考文献的方法，将样 本涂布于 CaF2窗片（直径13 mm，高2 mm）干燥成膜，以空白窗片为背景。 2.2.2 数据处理 OMNIC 7.0软件用于光谱的峰高较正、Savitzky Golay 五点平滑及傅里叶 去卷积（fourier selfdeconvolution, FSD）处理，其余的数据均由 Matlab 软件处理。 3 结果与讨论 3.1 实验方法的优化 由于不同波长所产生隐失波的穿透深度（depth of penetration，Dp）与 波长成正比关系（见公式1） ，当膜厚度过大时，在短波段区域因为穿透能力的 限制，造成与长波段区域不同的厚度穿透。因此，为保证中红外8004000 cm区域内所有波数穿透厚度相同，应使样品成膜厚度小于最短波长的穿透 深度，既可确保所有波长均能穿透样品膜，又减少了所需样品量，缩短了时间， 有利于实现样品的微量和快速检测。为观察光谱强度与蛋白浓度的线性相关、 确定适合的样品稀释倍数，将高浓度样品稀释成一系列样品，观察不同峰高和 蛋白浓度的线性关系（见图2A） 。从图2A 可以观察到在1652 cm的光谱强度 小于1.5（即透射率 T 小于4%）时，其各个波数峰的强度与血红蛋白浓度呈良好 的线性关系（r0.995） 。当样品浓度继续增加，长波段区域的线性关系优于短 波段。但在 Amide 、Amide 的特征谱带1652 cm、1540 cm处，其 下降的趋势分别与2958 cm, 3295 cm相当，应与峰的饱和性吸收相关 1。因此，考虑样品厚度与饱和吸收因素，在检测过程中将提取的血红蛋白稀 释10倍，使 HATR 谱在1652 cm处强度低于1，其成膜的厚度远小于0.5 m, 以保证各 HATR 谱各波数与样品膜厚度间良好的线性相关。多次重复实验也显示 良好的重现性（RSD4%） 。(n12sin2n22)1/2(1)其中, 为入 射光波长，n1与 n2分别为晶体与样品折射率， 代表入射角度，例如 ZnSe 晶 体折射率为2.4，在入射角为45， 为1000 cm （即10 m 时） ，蛋白样 品折射率通常为1.5，其穿透深度(Dp)为2.5 m。 参照文献10收集透射光谱，与 HATR 谱在谱形上保持一致，并未观察到 波数位移的现象（见图2B） 。但在吸收强度上，HATR 多次折射所产生的吸收强 度大于透射谱近一个数量级，表明 HATR 对样品的灵敏性更高，样品的用量更小。 3.2 实验数据处理 在此基础上，共获得107份样本的红外光谱，经5点平滑处理后，分别计算 了两组样品的平均光谱（见图3） 。在谱形上，两组光谱保持一致，在 1652、1542和 3295 cm处有3个强吸收峰，分别归属为血红蛋白的mide 、mide 和mide A（详见图3） ，是蛋白结构研究的重要区域。在 8001450 cm区间，由于红细胞成分复杂，除血红蛋白外，还含有从膜中 释放的磷脂类组分及细胞内高能磷酸类化合物如2,3 二磷酸甘油酸 （2,3diphosphoglycerate ，DPG） 、ATP 及碳水化合物，其谱带为以上几组物 质的共同作用的结果。在强度上，两组光谱的主要的吸收峰存在明显差异。如 在1652 cm吸收峰的平均峰高及标准误差（SD）在地中海贫血组与正常组中 分别为0.530.14和0.830.16，前者显著低于后者（p0.001） ，可做为红外 诊断地中海贫血的量化指标之一。而地中海贫血组内个体间的差异并不比正常 组的大。 由于不同样品间存在浓度差异，需要用光谱归一化、乘谱及相对强度等方 法消除浓度的影响，来比较光谱中结构与组分的差异。在光谱的诊断研究中， 相对强度常被用作诊断依据。根据 LambertBeer 定律，峰强度 A()主要依 赖物质分子吸光系数 ()、密度与膜厚（见公式2） ，运用相对强度可消除膜 厚影响，体现两组分分子吸光系数 ()与密度关系。（）（） deL, 当 L 相同时 （）（）（）de1（）de2(2) 但在通常的相对光谱方法中，只涉及到少量几个峰位间的相对强度。而在生物 大分子体系中，物质组成与结构复杂，谱带常发生重叠，从而丢失了大量隐含 于光谱中的物质组分与结构的信息。因此，在光谱处理中采用了一种改进的相 对强度计算法。在800 cm 到 1780 cm光谱范围，以最低处1780 cm做为光谱基线，分别计算光谱中每一波数与其它波数之间的相对强度11。 在光谱分辩率为4 cm设置下，在该区间共有509波数点。因此，每一光谱均 可获得509509的相对强度矩阵。在正常组或 重型地中海贫血组，可以分 别得到每一相对强度的平均值及标准差，通过比较组间平均值与标准差 D 值 （D=Abs(M 正常M)(SD 正常+SD)，Abs 代表绝对值，M 正常、M 分别 表示各自平均值，SD 正常，SD 表示其标准差） ，用于量化两组间相对强度的 差异。图4显示了 重型地中海贫血与正常组间其相对强度的 D 值大于零的 部分，纵坐标表示 D 值大小，可用来指示相对强度差异大小。用 t 检验该部分 相对强度，均表现统计显著性（p0.001） 。 在8001780 cm范围内， 重型地中海贫血与正常对照组之间，大 于零的 D 值占整个矩阵的9.34%，大部分位于由11001654 cm和 10061080 cm所构成的矩形范围内，并呈现出明显的对称分布。这种对称 分布源于相对强度沿其对角线成倒数关系。但 D 值大小并不一致。在谱带的分 析上，10061080 cm主要归属为 OPO 的对称伸缩振动，应来自于血红蛋白 中游离的高能磷酸化合物，如 DPG 或 ATP 等；而11001654 cm区域，主要 源自蛋白（Amide ， Amide ，Amide ） 、脂类（ 1455 cm附近与1172 cm附近）及碳水化合物（1150 cm） （见图3） 。以上数据呈现一个整体 的趋势，即显著差异主要来源于蛋白、脂类、碳水化合物与磷酸化合物的比值。 以下分别对以上几类物质的变化进行阐述。 3.2.1 蛋白质（Amide 与 Amide ） 14701700 cm为 Amide 、Amide 区域与10001108 cm（磷 酸化合物）的相对比值在两组间呈显著差异，如最大 D 值 I1638/I1064（0.292） 。由于谱带重叠，1638 cm峰在原始光谱上并未显现。 为此，实验利用去卷积半高宽（Bandwidth at half height，FWHH）20 cm,分 辨率提高因子（Resolution enhancement factor）2.0对其进行去卷积处理 （见图4B） 。由于分辨率的提高，二阶导数谱和 FSD 谱均显示了原始光谱中 1682、1638和1628 cm处隐含的子峰。在谱带归属上，应来源于两段螺旋间 的短肽12, 13，1638 cm处两组间的显著差异表明该结构与 珠蛋白 存在较强的正相关。除此之外， I1652/I1064在两组间也存在较大差异，其 D 值为0.1482。在血红蛋白的二级结构中，该谱带与 螺旋结构数相关。正常 血红蛋白中 珠蛋白为8个， 珠蛋白为7个，在 重型地中海贫血中由 于 珠蛋白缺失， 螺旋数减少，光谱呈弱的吸收强度，对两组的相对强 度造成一定影响。 3.2.2 脂类 在13501500 cm区间及1172 cm附近，其谱带归属为脂类物质。 该区域与磷酸化合物的相对强度均呈显著差异，如 I1440/1064、I1453/1064和 I1172/1064处其 D 值分别为0.120、0.115和0.089。特别在 I1172/I1064的相对 强度上，两组表现出强的组间特异性（见图4C） ，两组样本能被该值完全正确区 分。该脂类物质应主要来源于红细胞膜所释放的磷脂或胆固醇类成分13。红 细胞中，胞内血红蛋白的浓度、性质与膜的流动性及渗透能力相关。在 重 型地中海贫血中，由于 珠蛋白的缺失，易使过剩的 珠蛋白及降解物沉 积于膜上，导致膜的性质改变，脂类释放能力降低，对两组的相对强度差异有 一定贡献。 3.2.3 磷酸化合物 在10001108 cm附近，该区间与蛋白、脂类化合物均呈显著差异，归 属为 OPO 对称伸缩振动，主要来源于红细胞内含的 DPG 等高能磷酸化合物。在 红细胞中，DPG 浓度与 Hb 相当，为 Hb 氧亲合力调节的重要因子。在缺氧条件 下，DPG 在胞内浓度升高促使氧离曲线发生右移，增强组织对氧的摄取。Ting 15和 Labotka 16用核磁共振对 重型地中海贫血的 DPG 水平进行检测， 认为在 地中海贫血中，由于有效血红蛋白量减少，DPG 在红细胞内浓度增 加，以缓解机体的缺氧状态。因此，正常组与 地中海贫血组中磷酸化合物 的改变对相对强度的差异有着较大的贡献。 3.2.4 其它化合物 在24803600 cm区间（见图5A） ，大于零的 D 值仅占到0.67%的比例， 最大 D 值为0.0033，来自于 I2 541/I2 561的相对强度。在2553 cm附近， 谱带归属为弱的 SH 伸缩振动吸收，常用于表征血红蛋白的氧合能力17。在正 常的人血红蛋白分子中，共含有6个 SH 基团，其中 珠蛋白链2个， 珠 蛋白链1个。Liu 等10曾比较过2553 cm处表征 珠蛋白链的 SH，在 重型地中海贫血组与正常组间存在显著差异，认为源于 珠蛋白相对过 剩。但由于该谱带较宽，2541和2561 cm附近其吸收峰并未显现。为此， FWHH 20 cm , REF 2.0用于 FSD 处理（见图5B ） 。在2541 cm处，两组均 呈明显的小肩峰， 重型地中海贫血组的强度明显高于正常组；而 2561cm处，地中海贫血组呈现明显的小峰，该峰在正常组中并未出现，推 测应与 珠蛋白的相对过剩有关。 4 结 论 应用 FTIRHATR 研究了健康人群与 重型地中海贫血患者的血红蛋白 及红细胞内含物。通过对样品成膜条件的控制，FTIR 谱呈现良好重复性及吸收 强度与样品浓度的线性关系，可实现样品的微量检测。通过对相对强度方法的 改进，可以从整体上观察到蛋白质、磷脂类、高能磷酸化合物及 SH 在地中海贫 血中的组成及结构差异：(1)由于地中海贫血组中 珠蛋白的严重缺失，与 正常组相比，在蛋白的结构如表征二级结构的1652、1638 cm及表征 SH 的 2553 cm附近的吸收峰呈明显下降；(2) 13501500 cm表征磷脂的吸 收峰在地中海贫血组中明显降低；(3)表征磷酸化合物的峰在地中海贫血组中呈 现强的吸收。通过该处理方法，可消除样品浓度所带来的影响因素，灵敏地揭 示群体数据中组分与结构在不同组间的显著差异，并对其进行量化处理。 致 谢 感谢广西医科大学陈萍教授、贾文广，广西工业生物技术中心杨登 峰、孙靓、孙菲菲和肖代俊对本文章的讨论及实验技术上的支持。 【参考文献】 WU JinGuang( 吴瑾光). 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