乳腺癌相关mirna的研究进展

乳腺癌相关微小 RNA 的研究进展 乳腺癌发生机制和癌细胞耐药机制至今仍尚未完全阐明；近年 来科研工作者对乳腺癌相关组织或细胞中微小 RNA（micro RNA,miRNA）进行了研究，为阐明乳腺癌的发生、发展机制，并对 其治疗提供了崭新的思路。 1 miRNA 简介 miRNA 是一类长度约为 1825 个核苷酸(nucleotide，nt)(平均 22 nt)的非编码小 RNA 分子，通过与 mRNA 的 3 端非翻译区 (3untranslated region，3UTR)结合而介导翻译水平的调控。miRNA 基因在 RNA 聚合酶 的指导下，转录成命名为 pri miRNA 的初级 转录物。然后 pri miRNA 进入由 Drosha 酶和辅助因子 DGCR8(Disgorge syndrome critical region gene 8)Pasha 所构成的复 合体中，在细胞核中被剪切成长约 6070 nt）、具有发夹结构的 miRNA 前体(precursor microRNA，pre miRNA)。在核膜转运蛋白 （exportin） 5(Exp5)的协助下，pre microRNA 从核内被转运到胞 质中，经 Dicer 酶的作用被进一步剪切成 2125 nt 的成熟 miRNA。成熟的 miORNA 整合入基因沉默复合体(RNA induced silencingcomplex，Rlsc)形成 miRISC 复合物，通过直接剪切靶 mRNA 或者与靶 mRNA 的非翻译区互补结合，抑制靶 mRNA 的翻 译、影响蛋向质的合成，从而来调控多种生物学行为。miRNA 涉及 的主要生物学领域有：干细胞的分化1，细胞的凋亡2，出 生缺陷3以及肿瘤的发生4。 2 miRNA 的研究方法 mRNA 的研究方法主要包括两大类，即生物信息学分析和生物 学实验方法。在 miRNA 研究的初期，生物信息学方法发挥了非常 重要的作用，可为 miRNA 研究提供有益的线索，指导实验的进行。 而生物学实验则能提供直接而有力的证据，对预测结果加以确认。 二者各有优势，互为补充，有机地将 miRNA 的生物信息学分析方 法和生物学实验方法相结合，是 miRNA 研究的合理选择。 2.1 生物信息学分析方法 2.1.1 miRNA 基因预测 miRNA 克隆是发现 miRNA 基因的主要 方法，但该方法存在许多缺陷，比如由于受所选取的组织样品量的 限制，一些低表达量的 miRNA 可能会被遗漏，出现假阴性的结果。 随着人们对 miRNA 结构特点及保守性的逐渐了解，依据 miRNA 在 进化过程中的保守性及其茎环结构的前体结构特点编写计算机程序， 对 miRNA 进行预测正成为寻找新 miRNA 基因的主要方法。Lim 等 使用 MjrScan 软件，分别在线虫和人中鉴定了 30 个和 38 个新的 miRNA 基因5。MirScan 采用了一种独特的算法，即首先通过 RNA fold 软件寻找保守的并且可以形成茎环结构的序列作为候选 miRNA 前体，然后再与已知 miRNA 进行相似性比较，对候选前体 评分，得分超过某一设定域值者作为候选的 miRNA 基因6。但 只有少数候选 miRNA 基因已被实验确证：还有些候选基因的表达 模式尚未知晓，未检测出其表达，因而出现假阳性结果7。 2.1.2 miRNA 靶基因预测 成熟的 miRNA 通过其序列 5端的 28 个碱基(seed 区) 与 mRNA 上的相应靶点结合，发挥其抑制翻译 和诱导 mRNA 降解的功能8。人们只有先对 miRNA 靶基因进行 预测，才能对 miRNA 靶基因开展鉴定和功能研究等后续工作。从 已知的 miRNA 与靶基因的相互作用中，人们发现 miRNA 5端的 seed 区可以与靶 mRNA 3端 UTR 区或者 CDS 区结合。因此，这一 特点被各种靶基因预测方法广泛采用。同时结合 miRNA 与靶基因 形成二聚体的热力学稳定性和二级结构分析软件，如 MFold、RNAFold 和 RNAhybrid 等，以及将 miRNA 的 57 端与靶基 因的互补情况等作为其他限制条件来进行 miRNA 靶基因预测。目 前，不同研究小组已开发出多个 miRNA 靶基因预测软件，如 TargetScan、 miR。anda、Pictar 、DIANA Micr。oT 和 miRBase Targets 等。 不同的预测方法，其程序算法不尽相同，结果很可能有较大偏 筹；为减小不同方法带来的偏差，在实际应用中，需要多种算法联 合分析。例如9：当分析 miRNA 在人血管紧张素 I 型受体 (hAT1R)基因上的靶位时，miRanda 软件预测出 27 个结合位点， TargetScan 预测结果超过 37 个结合位点，其中有 8 个位点与 miRanda 结果重复：而应用 PicTar 算法，却未找到结合位点。也有 观点表明：至少应由上述两种算法预测出的 miRNA 的结合位点， 才对后续的 miRNA 靶位的证明实验有较大意义10。 2.2 miRNA 靶标基因的体外验证 在生物信息学软件预测之后， 为了排除预测的无功能位点和进一步对 miRNA 进行功能研究，还 需进行 miRNA 靶标基因的确认和鉴定。该实验过程需先将靶 mRNA 完整的 3UTR 序列克隆至 SV40 启动子驱动的报告基因(通常 为萤火虫荧光素酶)的下游，如果一个特定 miRNA 可以与这个靶 mRNA3UTR 相结合，就会抑制报告蛋白的生成，因此可通过检测 被抑制的报告蛋白的活性(或表达程度)，来判断 miRNAmRNA 之 间的交互作用10。该方法简单易行，但其只是一种体外验证方 法，不能完全模拟体内真实的调控环境。因此，当探讨特意 miRNA 在某一生理或病理过程中的功能、宣召其靶基因时，应选择合适的 细胞膜性或其他有效的实验工具。 2.3 miRNA 与 mRNA 的共表达及 miRNA 对靶蛋白的作用 一 种 miRNA 只有与其靶基因 mRNA 在生物体内共表达(co expression)， 才能发挥其抑制靶基因表达的功能。miRNA 与其靶基因是否共表达， 可以简单地通过 northern blot 或者荧光定量 PCR(qPCR)来证实。由 于 TaqMan 定量 PCR 方法操作简便，可重复性强，被推荐为分析特 定 miRNA 与靶 mRNA 的常用方法。例如，生物信息学预测 hATlR 基因的 3UTR 区存在 miR 155 的结合位点，研究者提取了血管平 滑肌细胞(VSMCs)的总 RNA，并以此为模板进行 qPCR 检测，分析 hATlR 和 miR.155 二者是否在特定细胞中存在共表达的现象。研究 结果表明 hATlR 和 miR 155 均在 VSMCs 细胞中有表达，并且 hATIR 的表达水平受 miR 155 的抑制11。 此外，研究者还可以利用 miRNA 对靶蛋白的调控，来证实 miRNA 对靶点的作用。通常是先将存在 miRNAmRNA 共表达的 细胞暂时过度的表达所要研究的 miRNA，利用 Western 印迹方法分 析靶基因所编码蛋白的表达变化，从而进一步验证 miRNA 对靶蛋 白的作用。除 Western blot 以外，ELISA 或者免疫化学荧光试验方 法也可以用来对蛋白质的表达进行定量的研究。 2.4 miRNA 生物学功能的研究 如果通过实验能够证实某个 miRNA 可以对其靶基因进行相应的调控，则需进一步研究 miRNA 的生物学功能。主要包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁 移等常规生物学方法，还可以通过检测细胞表型改变等间接方法研 究 miRNA 对蛋白质的影响12。 3 乳腺癌细胞中 miRNA 的相关特征 研究者以乳腺癌细胞系、正常乳腺组织和乳腺癌组织作为研究 对象，利用不同方法检测出众多与乳腺癌相关的 miRNA，然后利用 某些分子生物学标记和细胞代谢活动的相关数据，推测这些 miRNA 的功能。在乳腺癌中各种 miRNAs 的功能不尽相同，对于其功能的 分类也会因需要而有所差异；这里我们把乳腺癌相关 miRNA 分为 癌基因 miRNA 和抑癌基因 miRNA 两类：当某些 miRNA 的表达在 肿瘤中升高时，就被看做是癌基因；反之，则为抑癌基因14。 3.1 抑癌基因 miRNA 3.1.1 miR 206 miR 206 是 Iorio 等比较正常乳腺组织与癌组 织中 miRNA 表达差异时，最早发现的与乳腺癌发生相关 miRNA14。miR 206 在乳腺癌中的表达水平和 ER 的表达成负 相关，机制比较复杂，包括蛋白质的磷酸化、乙酰化、SUMO 化修 饰、多泛素化修饰等。在 ER 阴性乳腺癌细胞中，其表达量有所 上升，提示 miR 206 的功能可能与下调 ER 基因的表达有关。 Adams 等发现：miR 206 可以与 ER 受体 mRNA 的 3UTR 端两 个特异序列结合，下调 ER Q 的翻译，而不会影响 ER 13 基因的 表达；同时发现雌二醇（E2)或特异性 ER 激动剂 PPT 也能明显 下调 miR 206 的水平。值得注意的是，ER 激活剂可以抑制 miR 206 的表达， ER 激活剂或者黄体激素却没有抑制作用，这 说 明 miR 206 对 ER 基因表达的调控 网络中存在反馈调节。 此外他们还发现 mir21、let27d 也能调控 ER mRNA 的表达水平， 提示不同的 miRNA 可以调控同一个靶基因15。在 ER 阳性 乳腺癌细胞中，miR 206 的表达量则明显下降，若再将 miR 206 转入雌激素依赖的 MCF 7 乳腺癌细胞中，癌细胞的增殖受到抑制， 这同样说明 miR 206 对乳腺癌细胞中 ER 的表达的负调控作用 16。miR 206 可能在乳腺癌恶性转化及其转化过程中 ER 受体 表达缺失导致非雌激素依赖性生长中起调控作用，但具体功能仍有 待于进一步研究17。 3.1.2 miR 17 5p miR 17 5p 是来源于经常发生杂合子丢 失(LOH)的染色体 13q31 区域的一簇 miRNA。有学者通过生物信息 学算法推测 miR 17 5p 的潜在靶点为 AIB1 一种可以上调 ER 和 E2F1 转录的转录辅助激活因子18，19。miR 17 5p 通过抑 制 AIBl 的表达，从而使 ER 和 E2F 的表达发生改变。降低 AIBl 的 表达可以使 E2 依赖性的乳腺癌细胞、非 E2 依赖性的乳腺癌细胞、 ER 菲依赖型的乳腺癌细胞的增殖速度下降20。此外， miR 17 5pmiR 20a 家族的表达水平与肿瘤细胞中 cyclin D1 的 表达呈负相关性，miR 17 5pmiR 20a 通过与 cyclin D1 3端 UTR 区保守序列结合，来抑制 cyclin D1 的翻译。 cyclin D1 也可以 反馈调节 miR 17 5pmiR20a 的表达，miR 17 5p 对细胞周期 的调控，可能是乳腺癌发生的原因之一21。 3.1.3 miR 27b 功胞色素 P450 1Bl(cytochrome P450，family 1，subfamily b，polypeptide 1，CYPIBI) 是细胞色素氧化酶 P450 家 族 1家族 B 的惟一成员：CYPlBl 的作用是催化某些致癌物和 17 的代谢；包括乳腺癌在内的众多肿瘤中都能检测到其过表达22。 CYPlBl 基因 mRNA 序列中所预测的 miRNA 结合位点与 miR 27b 的序列有良好的匹配关系。与正常组织细胞相对比，miR 27b 在乳 腺癌细胞 MCF7 中的表达水平明显下降，同时 CYP1B1 处于高表达 水平，由此说明 miR 27b 有下调 CYPlBl 表达的功能23。 3.1.4 miR 125a 和 miR 125b 这组 miRNA 在过度表达 HER2 的乳腺癌细胞中显著下调24。通过生物信息学方法在 HER2 和 HER3 基因 3UTR 区域发现了 miR 125 的靶点。在乳腺癌细胞中， 高表达的 HER2 基因和其蛋白产物，可导致乳腺肿瘤进一步的恶化 25。在细胞实验中，SKBR3( 一种 ErbB2 依赖性的人类乳腺癌细 胞系)细胞中 miR 125a 和 miR 125b 过表达，可以抑制 HER2、HER3 的转录、表达，从而降低 SKBR3 细胞的附壁生长能 力、细胞转移能力、侵袭力，起到了抑制肿瘤的作用。但 miR 125a、miR 125b 过表达对 HER2 非依赖性的乳腺癌细胞系 MCF10A 的抑制作用却不明显26。 3.1.5 miR 200c Hurteau 等应用生物信息学方法和定量 RT PCR 技术发现 miR 200c 的靶位之一是一种重要的肿瘤延长因 子 TCF8(也称作 EF1)，该因子介导上皮钙黏蛋白抑制物的转录和 乳腺癌上皮细胞的可塑性调定27。在原本低表达 miR 200c 的 MDA MB 231 乳腺癌细胞中，增加 miR 200c 的表达量后， TCF8 的水平出现下降，钙黏连蛋白 E 的水平有所恢复，细胞异型 性程度也有所下降28。miR 200c 的这种作用机制，可阻止乳 腺癌细胞“上皮 间充质细胞 (EMT)”的转变过程，也阻碍了细胞的 恶变29。 3.1.6 miR 335、miR 126 和 miR 206 miR 335、miR 126 和 miR 206 是一族可能与乳腺癌转移、扩散相关的 miRNA。通过 与非选择性的乳腺癌 MDA MB 231 细胞进行对比，研究者首先 找出了六种 (rrliR 335，miR 126，miR 206，miR 122a，miR 199a*，mi R 489)在高转移乳腺癌细胞系中表达量降低的 miRNA。在乳腺癌 骨转移细胞和肺转移细胞中，恢复 miR 335、 miR 126、miR 206 的表达水平后，小鼠模型中肿瘤 细胞的转移能力明显下降。在培养的细胞中，过度表达 miR 126 后可抑制细胞的增殖：而在体外试验中，miR 335 和 miR 206 的 表达可使细胞的侵袭力降低；在乳腺癌临床标本中，低表达 miR 335 和 miR 126 的临床病例，因肿瘤的恶性侵袭而表现为极 低的生存率。研究者还在侵袭性细胞找出了四个 miRNA 335 的直 接作用靶点，它们分别是蛋白酪氨酸性磷酸酶 (PTPRN2)，酪氨酸 蛋白激酶(MERTK) ，成分同生蛋白 C(TNC)和以 SRY 基因为基本成 员的一类控制发育的 SOX4。这些靶点的表达水平可以作为精确判 断肿瘤侵袭性依据17。 3.1.7 Let 7 家族 根据肿瘤干细胞假说，肿瘤干细胞与肿瘤的 发生、进展、转移、耐药以及复发有直接关系30。具有自我增 殖能力的乳腺癌干细胞(BT IC)可以通过分选纯化的 CD44+CD24 /low 细胞或者孤立悬浮培养的细胞球而获得。有实验 表明，从乳腺癌患者体内分离出来的细胞以及富含 CD44+CD24 /low 细胞的 Sk 3rd 细胞中，let 7 家族的 miRNA 在潜在的乳腺癌干细胞表达有显著的下降。在小鼠模型内，过表达 let 7 家族 miRNA 后，可以降低肿瘤细胞的增殖、形成乳腺球囊细 胞团、生长和转移的能力，因此在今后的临床治疗中，Let 7 家族 具有很大的应用前景31。 3.1.8 miR 205 在乳腺癌细胞 MCF 7、MDA MB 231 中， miR 205 表达比良性乳腺肿瘤细胞和正常乳腺细胞低。miR 205 可调控表皮生长因子 ErbB3 和血管内皮生长因子 A(VEGF A)， miR 205 通过直接与靶蛋白 mRNA 的 3 UTR 端结合，抑制靶蛋 白的生成。在肿瘤细胞中过表达 miR 205，可以抑制癌细胞的增殖、 非停泊性生长和侵袭32。因此在乳腺癌细胞中转染 miR 205 可以在未来临床中，作为治疗乳腺恶性肿瘤的方法。 3.2 起癌基因作用的 miRNA 3.2.1 miR 21 科研工作者应用实时 R PCR 研究 5 种乳腺癌 肿瘤中的 157 种 miRNA 时，发现 miR 21 的表达明显升高33， 并发现敲除 miR 21 的 MCF 7 乳腺癌细胞表现为敲除量依赖性的 低生长、高凋亡；在小鼠转移模型中 miR 21 有抑制肿瘤增殖和降 低肿瘤标记物 Ki 67 抗体结合能力的作用34。为进一步了解 miR 21 作用的分子生物学机制，应用蛋白质组学的方法，对比过 表达的肿瘤细胞和 miR 21 敲除的肿瘤细胞的蛋白质表达差异，发 现具有抑制肿瘤作用的原肌凝蛋白(TPMl)是潜在靶点之一35。 Yan LX 等检测了 113 例乳腺癌标本中 miR 21 的表达情况，可知 miR 21 高表达的患者由于早期症状不明显、癌细胞通过淋巴转移， 表现为愈后较差、生存期较短。因此 miR 21 可以作为乳腺癌预后 效果和疾病进展的一项监测指标36。近期 Wickljamasinghe NS 等人发现，E2 可以通过 ER 介导，使 miR 21 的靶位丢失，从而抑 制 miR 21 在 MCF 7 乳腺癌细胞中的表达37。 3.2.2 miR 155、miR 9 和 miR 10 研究人员在筛选乳腺癌 细胞和人正常乳腺上皮细胞之间差异表达的 miRNA 时，发现乳腺 癌细胞中 miR 155、miR 91、miR 10b 的表达量都有显著的上 升。不同于 miR 155 和 miR 9 的是，miR 10b 仅在转移的乳腺 癌细胞中高度表达。功能学研究表明，体外 miR 10b 的过度表达 可以促进细胞的迁徙和侵袭，在体内 miR 10b 则可以启动肿瘤的 侵袭和转移。研究人员还发现，与浸润性小叶癌相关的转录蛋白 Twist 的高表达，可直接诱导 miR 10b 的表达。 miR 10b 的推测 靶点为转录因子的同源异型盒 D10(HOXD10)，miR 10b 抑制 HOXD10 的翻译，导致细胞在启动转移基因的产物 RAs 同源基因 家族成员 C 的诱导下发生了一系列的异常变化38。 3.2.3 miR 27 miR 27a 是对 SKBr3 细胞应用凋亡前计量的组胺脱 乙酰激酶抑制剂 LAQ824 治疗后，表达下调的一种 miRNA39。 miR 27 潜在的靶点是细胞转录因子 ZBTB10RINZF，一种调控 细胞周期的特殊转录因子蛋白(SPl)的抑制物。miR 27 作为一种肿 瘤癌基因 miRNA，通过调节 ZBTB10 表达后从而使 SPl 蛋白过度表 达，引起细胞癌变；miR 27 也可使 SP2 和 SP3 过度表达，这同样 具有引起癌变的作用40。 3.2.4 miR 22 1222 乳腺癌 MCF7 和 T47D 细胞中过表达 miR 221 222，使雌激素受体表达量下降，同时高度表达 miR 221 222 的 MCF7 和 T47D 的细胞对于抗肿瘤药物他莫两芬 (tamoxifen)有耐药作用。由此推测 miR 221222 的靶位为雌激素 受体修复基因和乳腺癌抗激素治疗的基因41。 3.2.5 miR 210 miR 210 是 Foekens JA 等近期发现的与乳腺 癌相关的 miRNA。miR 210 是在低氧环境下被诱导产生、从而引 起细胞癌变42，并且与 ER+LNN 和 ER LNN 乳腺癌的转 移复发有密切关系，也是非转移性乳腺癌预后较差的有效标志之一 43。 4 展望 目前临床中，局部的手术范围日趋保守，化疗、放疗、内分泌 治疗及生物治疗等综合治疗的有效性使得乳腺癌的长期生存率不断 提高，生活质量也不断改善，但总生存率仍然不理想。生物分子靶 向治疗是一项十分有希望的治疗手段。寻找新的治疗靶点，正是目 前研究的热点。FDA 于 2007 年批准了 GSK 公司研发的针对 HER2 和 EGFR 的双靶点小分子靶向药物 Lapatinib，在临床上取得了比较 好的疗效。miRNA 的发现及其乳腺癌相关靶基因的确定，初步揭示 了其在乳腺癌发生和发展中的调控作用，为寻找乳腺癌生物治疗的 新靶标提供了很有希望的方向。如本文所述，一种 miRNA 有多个 相关的靶基因，如果以这些 miRNA 为治疗靶点，其效率可能远比 针对单一的靶基因高。同时恢复或沉默肿瘤相关的 miRNA 技术， 在乳腺癌的治疗领域中将会有潜在的应用前景。与 miRNA 功能相 似的 siRNA 相关药物已经进入临床试验阶段，但 miRNA 是内源性 的短链 RNA，因此理论上针对 miRNA 的治疗将比 siRNA 具有更高 的安全性。目前 miRNA 在乳腺癌的研究刚刚起步，对其功能及其 靶基因的认识还不清楚。miRNA 及其靶基因预测方法的日益成熟、 检测技术的日新月异，一定能够极大地推动 miRNA 在多种生理学 和病理学过程中的重要调控作用，而 miRNA 与肿瘤的相关研究为 肿瘤的预防和治疗开辟了崭新的领域，miRNA 的干扰技术有可能成 为治疗乳腺癌的一种新的手段。miRNA 基因芯片技术也很可能成为 肿瘤诊断的工具，以调控机体生命活动的 miRNA 为靶点或以 miRNA 为治疗手段的设想，以后可能会成为研究焦点。 【 参考文献】 1 Zhang BH,Pan XP,Anderson TA.MicroRNA：a new 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