中性粒细胞数量减少和功能失调的检测方法及临床意义(单)

中性粒细胞数量减少和功能失调的检测方法及临床意义 中性粒细胞是人体防御系统的重要组成部分，与机体的非特异性抗感染过程有关，该类 细胞具有强大的吞噬杀菌功能，其作用过程历经趋化运动，识别并结合吞噬物质，进而摄入 胞内，最终杀伤并降解病原体。 目前，中性粒细胞作为急性炎症的重要指标之一，国内大部分实验室仅做常规的白细胞 计数，个别实验室采用趋化试验和吞噬功能检查，但远不能反映中性粒细胞吞噬杀灭病原体 的复杂过程。因此，有必要开展新的检测技术，从各个环节找出中性粒细胞功能失调的原因， 为临床诊断由中性粒细胞减少和功能失调所造成的疾病提供帮助，现将这方面的进展作一概 括综述。 一、与中性粒细胞数量减少相关的疾病 正常人外周血白细胞总数为 4.0-10.0109/L，中性粒细胞约占 60%-70%。中性粒细胞的 过多或过少常与许多疾病的发生发展有关。当血液中中性粒细胞低于 0.5109/L，病人可因 非特异性抗感染能力的极度低下而致恶重感染。但是也有些病人尽管中性粒细胞缺乏较为严 重，但只要其皮肤和粘膜的天然屏障作用没有遭到破坏也能避免感染的发生。 中性粒细胞数量减少引起的疾病有网状发育不全，Kostmann 综合征，Shwachman- Diamond 综合征，Griscelli 综合征，Chediak-Higashi 综合征，高 IgM 综合征，自身免疫性 淋巴细胞增生等疾病。 二、与中性粒细胞功能失调相关的疾病 有些细菌被中性粒细胞吞噬后，能干扰吞噬体和溶酶体融合，或产生超氧化物歧化酶和 过氧化氢酶以逃避 活性氧中介物和活性氧中介物的杀伤作用，从而出现中性粒细胞功能失调， 引起机体非特异性抗感染能力低下，导致反复感染和一些免疫缺陷病。 中性粒细胞的吞噬杀菌是一个较复杂的过程，任何一环节的作用机制被阻断或发生障碍 能引起许多免疫缺陷病。例如,中性粒细胞趋化障碍可引起白细胞粘连缺陷综合征，Chediak- Higashi 综合征，高 IgE 综合征以及糖原储积病。中性粒细胞结合功能障碍主要造成白细胞 粘连缺陷综合征，脱颗粒功能障碍引起 Chekiak-Higashi 综合征或中性粒细胞特异性缺陷。 由各类酶缺陷造成的中性粒细胞杀菌活性障碍要引起慢性肉芽肿病。 三、中性粒细胞数量和功能的检测 中性粒细胞数量的检测常规采用外周血白细胞计数，亦可进行骨髓涂片，用苏木精-伊红 染色，观察骨髓祖细胞的发育过程，判断是否存在因细胞成熟障碍而导致白细胞数量减少。 2 中性粒细胞功能失调随其发生原因不同可采用多种辩证法，从不同角度加以检测，籍以 了解其功能失调的主要环节，协助临床采取针对防治措施。简述如下。 1. 趋化功能的检测 中性粒细胞受到某些化学因子的作用以后，可以向因子源方向移动， 这种现象称趋化作用，该化学物质称为趋化因子。受趋化因子作用后，中性粒细胞表面的 L- 选 择素数量增加，血管内皮细胞开始表达 P-选择素或 E-选择素。这两类选择素结合可使细 胞贴向血管壁。这时中性粒细胞迅速表达整合素，例如，淋巴细胞功能相关抗原 LAF-1 等， 与内皮细胞的配体结合，使中性粒细胞变扁，紧密粘贴内皮细胞，继而中性粒细胞变形移出 血管外，以阿米巴运动的方向因子源移动。这种过程多发生在毛细血管后微静脉血流缓慢处。 检测趋化作用通常用 Borden 小室法。该装置被 1 个带有 5-8m 大小不等孔径的滤膜分为 上下两室。上室置白细胞悬液，下室置趋化剂。通过趋化剂的扩散 ，在滤膜上形成一个浓度 梯度。滤膜经染色后，显微镜下测量中性粒细胞在膜内行进的距离，求其趋化单位。 国内也有用琼脂糖凝胶平板法。在含小牛血清 1%的琼脂平板上，用打孔器以每 3 孔为一 组打孔。在中央孔加细胞悬液，两侧分别加趋化因子或对照用培养液。经 37温育后固定染 色，测量细胞移动距离。 2. 结合功能检测 在内皮细胞上表达的 L-选择素/唾液糖蛋白，VLA-4/VCAM,CR3/纤维 素等大量粘附分子，能与活化的中性粒细胞上的相应配体强合。有报道将单细胞层的内皮细 胞作为生理性底物，在类似 Borden 小室的装置中，经一定的反应时间后，计数滤膜上皮内皮 细胞结合的中性粒细胞数，作为其结合能力的测定指标。内皮细胞用白细胞介素-1（IL-1）， 脂多糖（LPS），肿瘤坏死因子（TNF） 预处理后，或是在滤 膜下放置吸引剂，都可以使 移动和结合作用增强。 3. 吞噬功能的检验 将中性粒细胞与已标记台盼蓝染料的细菌共温，经洗涤除去未摄入 的细菌，再计数吞噬细菌的中性粒细胞数。运用这项技术既能解释抗体、补体成分、血浆蛋 白在吞噬作用中的重要性，又能获知病人血清的调理功能。 4. 杀伤功能的检测 中性粒细胞可通过溶酶体酶对吞入胞内的病原体或颗粒进行消化降 解。胞内杀菌机制复杂，目前认为真正的杀菌过程，是通过胞浆内的氧依赖性及氧非依赖性 胞内杀菌两条途径来完成。当吞噬细胞吞噬异物颗粒后，胞内代谢常由无氧酵解转化成有氧 氧化，胞内的杀伤过程常为一耗氧过程，髓过氧化物酶（MPO）-卤素系统是起杀伤作用的重 要物质。此外，吞噬细胞中低 pH 状态（pH 约 4.5）常限制细菌活力，溶酶体酶可溶解革兰氏 3 阳性细菌的细胞壁，它们与胞内阳离子蛋白，转铁蛋白，吞噬素等构成了氧非依赖的胞内杀 伤途径。 检测杀菌功能可用化学发光法。中性粒细胞在吞噬业经调理的金黄色葡萄球菌过程中， 伴有化学发光产生。其氧代谢活性与细菌的吞噬密切相关，杀菌能力与发光强度相平行。 Martin 和 Bhakdi 就是利用上述方法，在生理温度和中性环境下，通过化学发光仪检测中性 粒细胞对金黄色葡萄球菌的调理吞噬和杀伤作用。另外，Hamers 等用组合试验测定中性粒细 胞对大肠埃希菌的吞噬、杀伤和降解。在该试验中他们用大肠埃希菌 ML35 突变株。如果中性 粒细胞内大肠埃希菌被杀死，则可测出 -半乳糖苷酶的活性。 中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗骤增，耗氧量也相对增加。借助 DADPH 氧化酶，O 2降 解为 O2-，O 2-随后转化为 H2O2。因此临床也常用硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验来检测中性粒 细胞的胞内杀菌能力。当磷酸已糖旁路谢活力增强，葡萄糖 6-磷酸氧化脱氢时，加生产方式 NBT 接受所脱的氢，使原先呈淡苋色的 NBT 还原成点状或块状颗粒并沉积在胞浆内。 在氧非依赖的胞内杀伤途径中，存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中的阳离子蛋白，如酪蛋 白钙，也能对病原体起到杀伤作用，因此可利用钙螯合物染料与钙离子结合后发出的荧光来 测定细胞内游离的钙离子渡 度。最常用的染料有用于分光光度计的吲哚-1 和用于流式细胞 仪的荧光-3。Roos 等将带有趋化吸引剂的中性粒细胞温育后，发现钙离子浓度迅速升高。由 于细胞内储存的钙被释放，形成第一个浓度高峰。紧接着又由于细胞外钙的流入，形成第二 个峰。 5. 降解功能的检测 降解过程即浆膜对细胞内颗粒消化的过程，这个过程可测定上清液 里中性粒细胞的颗粒酶活性，或计数中性粒细胞表面的颗粒膜蛋白。后者主要用弹性蛋白酶 （结合 O1-抗胰蛋白酶）和乳酸合成酶分别标记由嗜天青特异性颗粒释放的蛋白。Kuijpers 等在实验中发现十四酸盐乙 酸盐（PMA）和 N-甲酰-蛋氨酰亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）只能降 低浆膜对特异性颗粒的消化能力。而 fMLP 结合了松弛素 B 后，能同时降低浆膜对特异性颗粒 和嗜天青颗粒的消化。 6. 其他检测 测定针对中性粒细胞功能活性的信号传导途径，或用单克隆抗 体测定中 性粒细胞表面受体和结合蛋白的表达。如 Fc