p53基因调控研究的新进展

p53 基因调控研究的新进展 朱荻绮 陈 敏 审阅 李 稻 上海第二医科大学病理生理学教研室 200025 摘要 p53 作为抑癌基因，其激活与调控机制的研究是近年的热点。DNA 受损等应激 信号可活化 p53，诱导细胞周期调控和细胞凋亡为主的多种细胞学反应，而 MDM2、YY1 等作为 p53 的负反馈调控因子，控制 p53 过度活化。近来发现，p53 可上调 p21 基因表达 产物 p21WAF1 蛋白使细胞周期阻滞于 G1 期；同时，激活 GADD45 参与对 G2 的阻滞；亦可 通过 caspasee 介导的 ERK2/MAPK 的细胞裂解通路抑制细胞增殖。另外，p53 通过 BH3- only 蛋白激活 Bax、正调控 puma 和 noxa、抑制 Bcl-2 等多种途径共同诱导细胞凋亡，p53 家族成员 p63 和 p73 也参与 p53 诱导的凋亡过程。 关键词 细胞周期；凋亡；p53；p21；Bcl-2；MDM2 p53 属于抑癌基因家族，位于染色体 17p13.1，基因全长 1620kb，含 11 个外显 子，211 外显子编码分子量为 53kD 的 p53 核内磷酸化蛋白。正常野生型 p53 活化后 可诱导多种细胞生物学行为，如调控细胞 周期、诱导细胞凋亡、细胞分化、细胞衰 老、DNA 修复，以及抑制血管生成等。在 细胞周期中，p53 蛋白通过阻止 G1 期细胞 进入 S 期，使受损的 DNA 或染色体有时间 得以修复；若 DNA 或染色体损伤过于严重 时，p53 能触发凋亡机制清除受损的细胞。 近来，p53 研究的热点集中在自身表达、细 胞周期调控和诱导细胞凋亡。 1p53 基因调控 p53 基因受多种信号因子的调控，其中 较为重要的负反馈调控因子是 MDM2。 MDM2 是一种对 p53 特效的 E3 泛素连接酶，为原癌基因 mdm2 的基因产 物。mdm2 是一种进化的保守基因，具有 转录因子功能，其编码的基因产物能与 p53 结合，使 p53 介导的反式激活、抑制细胞 增殖和诱导凋亡的作用受抑制，解除细胞 G1 期的阻滞并重新进入细胞周期 1。研究 表明， 尽管 p53 蛋白只在核内发挥作用， 但其从核内向外移出可能依赖 MDM2 途径 的调控。p53 蛋白的出核是决定其降解的关 键。MDM2 与 p53 蛋白结合构成寡二聚体 复合物，mdm2 过度表达时，通过与 p53 蛋白酸性活化区直接结合可抑制 p53 的转 录活性。由于 MDM2 的水平受到 p53(wt) 调控，因而，在 MDM2 与 p53 之间形成负 调节反馈环，以保持 MDM2 与 p53 蛋白之 间比率的恒定 。DNA 损伤可使 p53 蛋白的 多个部位发生磷酸化，包括与 MDM2 结合 的部位，从而阻止 MDM2 与 p53 蛋白的结 合。此外，MDM2 还能与核糖体蛋白 L5、L11 和 L23 结合，所以细胞内至少存 在两种 MDM2-核糖体蛋白复合物： MDM2-L5-L11-L2 和 p53-MDM2-L5-L11- L23，其中 MDM2-L5-L11-L23 复合物能抑 制 p53 的活化 2。但是，L11 和 L23 都被证 实能抑制 MDM2 对 p53 蛋白的降解作用， 进而增强 p53 表达。L5 的过表达能稳定 H1299 细胞中的异位 p53；以及稳定 U2OS 细胞中内生的 p53，因此，L5 能提高 p53 的转录活性并且诱导 p53 依赖的细胞 G1 期 的阻滞。与 L11 和 L23 一样，L5 能显著地 抑制 MDM2 对 p53 蛋白的降解作用。 转录因子 Yin Yang1（YY1）是肿瘤抑 制基因 p53 的另一调控因子。YY1 与 p53 相互影响，通过抑制 p53 与其共活化物 p300 的相互作用，控制 p53 的转录活性和 乙酰化，并且破坏 p53 的稳定性。再者， YY1 也能与 MDM2 基因的相互作用， MDM2 表达的增强促进了 p53-MDM2 复合 物的装配 3。 肿瘤抑制基因 INK4aARF 编码蛋白 p19ARF（半衰期约为 6 小时）是抑癌基因 p53 的激活因子。它通过与 MDM2、E3 蛋 白连接酶结合来活化 p53，并通过抑制 MDM2 来提高 p53 蛋白的功能稳定性，调 节细胞功能，但是这些分子并不控制 p19ARF 翻折，相反，一种能与 p19ARF 结合 的核仁蛋白 nucleophosmin/B23 能延缓它的 翻折。突变的 p19ARF 不能有效地与 nucleophosmin/B23 结合，因而是不稳定的， 并且功能减弱 4。细胞受损后，内生的 p19ARF 蛋白与 MDM2 形成沉淀物停留在细 胞核内，这一过程在缺乏功能性 p53 的细 胞中是不存在的 5。 2p53 蛋白对细胞周期的调控 研究中发现，在哺乳动物中，如果细 胞的 DNA 受损或者遭受到其它类型的损伤 时，p53 蛋白能够阻止其细胞周期从 G1 进 入 S 期。另外， p53 蛋白也能通过结合转 录因子 E2F，使 E2F 不能够结合到一些原 癌基因（例如 c-myc，c-fos）的启动子上， 实现对细胞周期的阻滞。这表明 p53 蛋白 在某些细胞的增殖周期调控过程中起关键 作用。p53 蛋白在正常机体生长和发育过程 中似乎未发挥十分重要的作用，敲除 p53 的小鼠仍可产生相当正常的后代。但是由 于 p53 的缺失，使得基因损伤不断积聚， 机体无法控制异变细胞的生长，最终导致 机体的死亡。因此，这些小鼠的寿命通常 小于 6 个月，其原因是敲除 p53 的细胞对 癌变十分敏感 6 。 大量实验研究表明，p53 可在多种信号 因素作用下活化，其中包括致癌因素诱导 的 DNA 损伤和不正常的增殖信号。缺氧和 细胞粘附力降低是最常见的两种增殖信号。 活化的 p53 蛋白可暴露出蛋白质-蛋白质、 蛋白质-DNA 结合的结构域。例如，与特异 性双链或单链 DNA 序列结合的 p53 蛋白结 构域，大约由 200 个氨基酸残基组成，位 于 p53 蛋白的中间部分，相当于 100 到 300 氨基酸残基之间。p53 蛋白与特异性 DNA 序列结合的生物学特性决定了它能对受损 细胞的生长起到阻滞的作用 6。 在细胞周期调控和修复过程中，p53 蛋 白重要的效应是上调 p21 基因的表达。p21 表达产物 p21WAF1 蛋白是一种依赖 cyclin 激 酶（cdk）的抑制剂。作为对 p53 的高表达 和 DNA 损伤的应答，p21 WAF1 蛋白能够阻 滞细胞周期于 G1 期。p21 WAF1 蛋白主要结 合于 G1 期和 S 期的 cyclin-cdk 复合体，但 几乎不与 cyclin-ckd2 相结合。另外，p21 WAF1 蛋白通过与增殖细胞核抗原（PCNA） 相联系，使 DNA 聚合酶的活性下降，损伤 细胞的 DNA 复制过程转变成为 DNA 修复 7。近来，Timothy K. Maclachlan 等人发现 BRCAI 能够稳定 p53 调控的 DNA 修复和 生长阻滞的基因转录。在对阿霉素反应中， BRCAI 被认为是通过 p53 依赖方式减少细 胞死亡，这与调控获得结果基本上是一致 的。这表明 BRCAI 能有选择地与 p53 转录 因子共同作用，激活参与 DNA 修复和细胞 周期阻滞的基因，但其并不作用于诱导细 胞凋亡的基因 8。 p53 蛋白对 G2 期的影响是由多种靶基 因参与、多种机制共同作用而实现的。p53 蛋白可激活和上调 GADD45 基因表达， GADD45 蛋白与 P21 蛋白一样可以结合到 PCNA 上，也能结合和抑制 cyclinB-cdc2 复 合物使得细胞周期阻滞于 G2 期。p53 靶基 因编码 14-3-3-sigma 蛋白能识别 cdc25c 的 磷酸化形式并将其移出它的周期，以保护 cyclinB-cdc2 的活性。B99，一个 p53 靶基 因的蛋白产物，主要位于 G2 期的微管中， 它在 p53 蛋白负调中表达可诱导细胞 G2 期 的阻滞 7。 最近，研究发现 p53 能够通过 caspase 介导的 ERK2/MAPK 的细胞裂解通路来抑 制细胞增殖。刺激 Ras/MAPK 级联 (stimulation of the Ras/MAPK cascade)可以 激活 p53，促进细胞停止增殖并使其凋亡， 或者降解 p53 蛋白，促进细胞存活。但 A Marchetti 等人证明 p53 能够通过使 ERK2/MAPK 失活来直接阻止 Ras/MAPK - 3 - 发出信号，ERK2/MAPK 的失活取决于 ERK2 蛋白的 caspase 裂解，而且 ERK2/MAPK 的失活可以诱导 p53 介导的 生长阻滞 9。在 Ras 基因转染细胞中，细胞 阻滞是由 p53 蛋白诱导的，而并非是 p21 WAF1 蛋白，并且与 ERK2 的活性、 磷酸化 水平和蛋白质半衰期的大幅度降低有关， 并且有 caspase 的活化出现。而且，DNA 损伤诱导的细胞周期阻滞与 p53 依赖的 ERK2 的下调以及 caspase 的活化相关 9 。 除此之外，caspase 的抑制物或耐 caspase 的 ERK2 基因突变产物的表达会干扰 EPK2 的降解，并在 p53 存在的情况下仍然可以 进行细胞增殖，表明了 caspase 介导的 ERK2 的降解促成了 p53 诱导的生长阻滞。 这些发现强有力的证明了 ERK2 是 p53 在 细胞周期调控中的又一个靶基因 9。 3p53 蛋白诱导细胞凋亡 如细胞损伤较大、不能够被修复时， p53 蛋白会促使细胞进行凋亡。在无细胞核 的细胞实验中证实，p53 蛋白能直接从胞质 参与凋亡程序，通过促进线粒体 MMP 的 开放释放细胞色素 c 导致 caspase 活化来诱 导细胞凋亡。细胞色素 c 与 Apaf- 1（apoptosis -activating- factor-1）结合，使 Apaf-1 构象发生变化，暴露 N 端 caspase 结合结构域 (caspase recruitment domain,CARD)。caspase-9 前体也具有 CARD 域 , 并通过 CARD-CARD 相互作 用，激活 caspase-9，启动细胞凋亡程序 10。 p53 诱导凋亡对抑制肿瘤发生起关键作 用。p53 蛋白能促进许多凋亡相关基因的表 达，已发现的靶基因超过 16 个，目前仍不 清楚哪一个是起决定作用的 11。其中， Bcl-2 家族的促凋亡成员：Bax 、NOXA 和 PUMA、p53AIP1 、死亡受体 Fas 和 PIDD、胞质蛋白 Apaf-1，是目前研究的重 要领域及热点。 Bcl-2 家族的一些共同含有第三个 Bcl- 2 同源结构域（BH3）的蛋白被称为 BH3- only 蛋白。BH3-only 蛋白以 “hit-and-run” 方式诱导构象变化，触发低聚反应，激活 Bax 和 Bak。Bax 和 Bak 包含三个 BH 结构 域，能使线粒体外膜通透性增加，促使线 粒体释放细胞色素 c 和其他蛋白。BH3- only 蛋白通过从 Bcl-2 或 Bcl-xL 释放出 Bid 和 Bim 来促进凋亡。p53 蛋白具有 BH3-only 蛋白相类似功能和转录因子作用， 能与 Bcl-xL 结合，这种结合需要 p53 蛋白 的富含脯氨酸的结构域。当 p53 蛋白与 Bcl-xL 结合后，可释放了先前与 Bcl-xL 结 合的 Bid 或 Bax，亦能使 Bak 从其抑制物 中释放出来，并使 Bak 活化。p53 诱导的 凋亡依赖于 Bax 和 Bak，以及在 MEF 部分 缺少情况下，也能抑制由原癌基因产生的 转化。目前，尽管尚未确切找到 p53 蛋白 与 Bax 结合的证据，但是实验发现 p53 蛋 白可以直接激活 Bax 使线粒体通透性增加， 通过连续途径使 DNA 损伤 12。此外，实验 也发现 noxa 和 puma（bbc3）编码的 BH3- only 蛋白也显得较为重要。在小鼠实验中， 尽管仅缺失 puma 并不会使淋巴细胞死亡， 但 noxa 或 puma 的任何一个降裂都会减少 成纤维细胞中由于 DNA 降解引起的细胞凋 亡。缺少 puma，人类结肠癌细胞的 p53 依 赖凋亡过程被抑制。实验证明，puma 在 DNA 损伤的凋亡中更为重要，而 noxa 作 用有限。puma 和 noxa 基因的转录均受 p53 正调控。Andres 等认为， puma 和 noxa 参与全部的 p53 介导的凋亡信号 11。 p53 蛋白通过与 Bcl-2 基因的 5-不翻 译区内的 p53 阴性反应元件相互作用，抑 制 Bcl-2 蛋白的表达。APAF-1 激活 caspase-9 时需要细胞色素 c 参与，但 Bcl-2 阻止线粒体细胞色素 c 的释放。哺乳动物 中，缺失 caspase-9 和 APAF-1 中的任何一 个，均会出现神经增生和淋巴细胞与成纤 维细胞抵抗凋亡刺激的能力增强。Bcl-2 的 过度表达使小鼠的淋巴细胞增长和抑制凋 亡刺激，说明 Bcl-2 调控细胞色素 c/Apaf- 1/caspase-9 活化过程，仅仅是扩大 caspase 的级联，而不是启动 13。 p53 蛋白通过结合到 pac1 启动子的复 发位置来激活 pac1 的转录。作为苏氨酸/酪 氨酸的双重磷酸酶，PAC1 特定地去磷酸化 和灭活 MAP（促细胞分裂原活化蛋白）激 酶。实验表明， 失血和氧化应激诱导 pac1 的转录，由此导致了 p53 依赖的凋亡，但 是对细胞周期的停止并无作用。pac1 转录 的还原抑制了 p53 介导的凋亡，然而，过 度表达的 PAC1 会增加其对于凋亡的敏感 性，抑制肿瘤的形成。p53 蛋白的激活会抑 制 MAP 激酶的活性 14。 p53 家族的成员, p63 和 p73 与 p53 结 构上相似，目前虽没有证据表明其与肿瘤 抑制有直接联系，但 p63 和 p73 的联合缺 失将破坏 p53 诱导凋亡的功能已被证实。 小鼠胚胎纤维母细胞（MEFs ）在表达了 E1A 原癌基因后会进行凋亡， MEFs 在阿 霉素处理后表现了凋亡的抗性。当 p63 和 p73 都缺失时，表现出与 p53 缺失一样的抗 性。Elsa 等人发现在缺乏 p63，p73 或 p63/p73 的细胞中，p21 和 mdm2 的水平 没有变化，而与凋亡反应是有关的 bax 和 PERP 的水平则减少了。细胞在受到 DNA 损伤试剂作用后，p53 蛋白和 p63 蛋白都在 核内分布，在野生型的细胞中 p53 蛋白， p63 和 p73 蛋白都能与 bax 和 PERP 启动 子相结合。但在缺乏 p63 和 p73 蛋白时， p53 蛋白不能与 bax 和 PERP 的启动子相 结合。这个研究说明了 p 63 和 p73 蛋白在 调控 p53 蛋白活性方面的作用，这也意味 着它们可能具有的肿瘤抑制作用 15。 许多实验已经证实，p53 能衡量细胞损 伤程度，并且根据损伤程度的大小对细胞 做出不同的“处理” ，如果损伤很小，p53 蛋白通过阻止 G1 期细胞进入 S 期，使受损 的 DNA 或染色体有时间得以修复；若 DNA 或染色体损伤严重时，p53 蛋白能触 发凋亡机制以去除受损的细胞。 那么哪些因素决定着受损细胞应该进 行生长阻滞或是进行细胞凋亡呢？在这个 问题上近年来，人们做了大量的研究， Laura D Attardi 等人发现在 MEFs 中，经 -射线处理过的 MEFs 发生了 p53 依赖的 G1 期阻滞，而用大量 DNA 损伤剂处理的 有肿瘤表达的 MEFs 发生了 p53 依赖的凋 亡 16。目前，一些影响细胞应答的因素已 经被提出。例如：细胞的类型，致癌细胞 的组成，应激反应的强度，p53 表达的水平， p53 与特定蛋白的相互作用以及 p53 启动子 的亲和力等因素影响着 p53 对特定信号的 应答。 值得关注的是，目前已有实验证实， 突变的 p53 虽未能诱导细胞凋亡，但能通 过阻滞细胞周期延迟肿瘤发生 17。 Rabiya 等人认为，p53 可能是通过细胞周期活性能 力来维持染色体组稳定，使肿瘤延迟发生， 但其具体机制有待进一步证实。 参考文献： 1 Tomoo Iwakuma et al. Mol. Cancer Re