不同地区桔梗多糖含量的比较

不同地区桔梗多糖含量的比较张小斌 （商洛学院生物医药工程系、中国中医研究院商洛中药材 GAP科研工程中心 陕西商洛 726000） 摘要 选取陕西商洛、安徽太和和吉林延边产桔梗，采用水提取法提取桔梗粗多糖， 分别测定粗多糖含量，采用三氯乙酸正丁醇法脱蛋白脱去多糖中粗蛋白，测 定精制多糖含量，比较三个地区桔梗粗多糖及精制多糖含量。结果显示，安徽 太和粗多糖含量最高，为 26.36%，其次为吉林延边桔梗，为 18.27%，陕西商 洛桔梗为 17.08%。提取粗多糖经精制后，安徽太和、陕西商洛、吉林延边桔梗 粗多糖蛋白去除率分别为：74.27%，68.08%和 69.36%，差异不显著。精制多糖 含量分别为：12.61%，15.42%和 11.42%。结果表明安徽太和桔梗多糖含量最高， 陕西商洛次之，最后为吉林延边桔梗。 关键词：桔梗；粗多糖；精制多糖；含量 中图分类号： 文献标识码： 文章 编号： Comparison the content of polysaccharide of platycodon in three areas Abstract: Select the platycodon,in shangluo, anhui tai and jilin in yanbian with water to extrac the crude polysaccharide of platycodon,ahd then crude polysaccharide is determined,Use the acid-n-buoh the different method to take off the protein in the polysaccharide crude, and then to determine the refined polysaccharide, compare the thick polysaccharides and refined polysaccharide of platycodon in these three areas.The result is showed that the highest content of polysaccharide in anhui tai, thick for 26.36%, followed by jilin yanbian balloon flower18.27%, the minimum is shangluo balloonflower, for 17.08%After the extraction of refined polysaccharide from crude polysaccharide,the balloonflower thick glycoprotein removal rate in anhui tai, shangluo, jilin yanbian is more than respectively 74.27%,68.08% and 69.36%, the difference is not significant. Refined polysaccharide is 12.61%，15.42% and 11.42%, the results show that the contents of polysaccharide in anhui tai balloonflower highest, in shangluo is the second smallest, and finally for jilin yanbian lisianthus. Key words: platycodon; crude polysaccharide; Refined polysaccharide; content 1.1 选题的目的 桔梗 1(Platycodon grandiflorum(Jacq)ADC)是桔梗科桔梗属、多 年生草本植物, 别名铃铛花、梗草、和尚头花、土人参、包袱花等。药用其根, 为桔梗科植物桔梗的干燥根。我国最早药书 神农本草经 有记载, 桔梗系 常用中药桔梗花大美丽，可供观赏，种子可榨油，根是一种常见的中药材。其 味苦、辛，性微温有宣肺、散寒、祛痰、排脓等功效，主治外感咳嗽、喉痹咽 痛、胸满肋痛等症。现代医学认为，桔梗富含桔梗皂甙、多糖、甾醇类、萜类、 桔梗酸等成分，并含有十几种氨基酸及铜、铁、锌、锰等 22种微量元素，具有 抗炎、止咳、化痰、抗溃疡、扩张血管、降血压、解热镇痛、镇静、降血糖、 促进胆酸分泌、抗过敏等许多药理及保健功能 2。除此以外，桔梗还可以作为 蔬菜食用，在朝鲜、韩国、日本及我国东北地区，人们食用桔梗的习惯十分普 遍。桔梗在我国分布较广，产于皖南山区、沿江丘陵地区及皖西大别山区，生 于海拔 1 600米以下的山坡草地、灌丛中，苏联 (西伯利亚)、日本也有。我省 我市也有大规模种植：如商洛丹凤县等。桔梗是商洛产地道药材 , 野生或栽培 均有。目前已形成了商洛桔梗规范化生产技术标准操作规程 3。为提取桔梗有 效中药成分，更好地利用这些植物资源，服务于地方经济建设，我们研究不同 地区桔梗中多糖的提取及测定，为评价桔梗药材及新选育品种的质量提供方法， 进一步用于生产实践打下基础。 1.2 选题的依据 多糖广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子及动物细胞膜、微生 物的细胞壁中，是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，也是构成生命 的四大基本物质之一。它在自然界中来源广泛，特别是在高等植物、动物、微 生物、地衣和海藻中含量丰富。多糖不但是生物体的主要结构成分，还具有复 杂的多方面的生物活性与功能。大量研究巳表明：多糖具有免疫调节、抗肿瘤、 抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗病毒、降血糖等多种生物活性，且多糖药物毒副 作用小、安全性高，在临床上得到广泛应用。近年来有关多糖的研究发展迅速， 从动物、植物和微生物等各种生物材料中提取的多糖具有免疫调节、抗肿瘤、 降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗病毒等方面的生理活性，已成为热点研 究领域。 桔梗多糖是一种菊糖型多聚糖，可开发为保健饮料和具有抑菌保健作用的 食用包装复合膜，是桔梗食用品质的主要评价指标。现代药理学研究发现桔梗 多糖还具有多种生物活性，如免疫调节、祛痰、保肝、消炎、改善胰岛素、增 强机体免疫功能及抗肿瘤等，具有广阔的开发前景。 桔梗多糖的含量与很多因素有关，例如不同产地、不同部位、不同生长年 限等，不同产地对桔梗多糖含量的影响关系到药材及新选育品种的质量。桔梗 药用最早见于神农本草经，弓晓杰 4等发现，桔梗提取物能促进肠促胰酶 肽的分泌，可用于治疗胰腺炎。 国内已经报导了不少关于植物多糖的提取方法及其抗氧化性的研究，如黄 茋多糖 5灵芝、枸杞复合多糖 6等。桔梗多糖含量的测定也屡见不鲜，如李妍 7的苯酚一硫酸法测定多糖含量，吴彦 8的桔梗中多糖含量的提取及测定，贾 林 9的桔梗多糖的提取与纯化，张莲姬 10桔梗多糖的提取方法及其抗氧化性的 研究等。桔梗做药用常用根部，桔梗根可制成美味的菜肴, 在朝鲜、韩国、日 本及我国东北地区将桔梗作为食用蔬菜的习惯十分普遍 11。桔梗根含多种皂苷, 混合皂苷完全水解产生桔梗皂苷 (platycodigenin)、远志酸 (polygalacic acid)以 及少量桔梗酸 A，并分离出桔梗皂苷 A、C、D。此外还含甾醇类化合物。桔梗 水提取物具有明显的药理作用。桔梗具有祛痰与镇咳作用，桔梗煎剂 1 g/kg 给 麻醉犬灌服后，能显著增加呼吸道粘液分泌量，其强度与氯化铵相似。桔梗的 根、根皮、茎、 叶、花、果均有显著的祛痰作用 12。桔梗水提取 750 mg/kg 腹腔注射，在机械刺激豚鼠气管粘膜实验中，镇咳效果达 60 %13。桔梗具有 抗炎作用，口服桔梗粗皂苷 200 mg/kg,对角叉菜胶及醋酸所致的大鼠足肿胀均 有明显抑制作用。用做药物开发是一般用水提物，主要是防止醇提取物对儿童 用药造成损害。桔梗水提取物具有抗肿瘤作用，桔梗菊粉给 ICR 系雌性小鼠于 1W 中间日灌胃，然后接种艾氏腹水癌细胞，接种于腹股沟后 30 d，每日口服 或腹腔给予菊粉组分，测定当时肿瘤重量与对照组比较，其抑制效果达 30 %40 %。对腹水型肿瘤小鼠也有相同作用。桔梗水提取物可导致体外培养的 人肺癌细胞 A549 生长抑制和凋亡，分子生物学的研究表明，桔梗水提取物引 起的细胞凋亡机制与端粒酶活性的降低和 Bc-2 表达的下调有关 14。 国外近年对桔梗的研究主要集中在:韩国学者对多糖类成分进行了大量研究， 发现桔梗多糖能激活促细胞分裂蛋白质酶活性。多糖具有降血糖的功能，Ukai Shigeo等从一种银耳(KINJI)的子实体或菌丝体中提取出抗高血糖的酸性多糖。 FujiiMakoto等从海藻类植物中提取出一种能够降低血糖水平的藻类多糖，并 制成了以岩藻依聚糖(Fucoidan)为主要成分的保健食品，它可以显著提高人们 的免疫功能。Honda Yasuki等从西洋樱草属(Polyanthus)植物中获得一种具有 良好的保湿、抗皱等作用的酸性杂多糖。Sawai Yasuko等从石菖蒲 (Acorusgramneus)的根茎中分离得到的多糖可抑制黑色素的产生，具有抗炎、 抗氧化作用，可用于黑变病的治疗，且因其具有良好的保湿作用，故又可作为 化妆品的有效成分。Shimomura 等从甲壳类动物的肉类降解产物中得到一种具 有美容功效的酸性多糖。实验证明，此酸性多糖可抑制延缓衰老的透明质酸的 分解，减少皮肤细纹和干裂，因而可作为美容食品和化妆品的有效成分。 2 材料、仪器及试剂 2.1 供试材料 陕西商洛、安徽太和和吉林延边三个地区产的桔梗。商洛桔梗购自香菊大药房， 太和桔梗购自北京同仁堂（亳州）药材基地，延边桔梗购自吉林省长春市中药 市场。所有桔梗均为 2011 年当地生产，分三个批次进行采样。 2.2 仪器及试剂 主要仪器：紫外分光光度计（722 型）; 恒温水浴锅（RE52-99 型 ）上海亚荣 生化仪器厂；真空泵(SHB-3 型)郑州杜甫仪器厂; 冷冻离心机(H-2050R 型 )长 沙湘仪离心机仪器有限公司;旋转蒸发仪(HHS-11-2 型)上海博迅实业有限医疗 设备公司;多功能粉碎机（878-A 型）常州国华电器有限公司;电冰箱。 试剂：牛血清蛋白和考马斯亮蓝购自西安西安国安生物科技有限公司；硫酸、 苯酚、葡萄糖、正丁醇、三氯乙酸等试剂均为分析纯，购自西安三浦化学试剂 有限公司。 3 试验方法 3.1 桔梗粗多糖的提取 不同地区桔梗根部-烘干、粉碎-热水浸提-抽滤去除残渣-蒸发浓缩 -离心去杂质-浓缩液醇析过夜-粗多糖 粉碎：采用粉碎机粉碎，过60目筛。 水浴浸提：将样品按设计的料水比，浸提温度，浸提时间，置于150m1的三 角锥瓶中用保鲜膜密封进行恒温水浴浸提。 醇析：经处理后的浸提液蒸发浓缩至原体积的15，4000rmin离心20分钟， 去除浓缩过程中出现的杂质沉淀。取上清液加入4倍体积95乙醇，放置4条 件下沉淀静置过夜。 3.2 桔梗粗多糖的精制 桔梗粗多糖的精制主要进行脱蛋白处理，脱蛋白的方法采用三氯乙酸-正丁 醇法脱蛋白法。将三氯乙酸和正丁醇按照体积比为 110 混合配制成三氯乙酸 正丁醇混合试剂，将桔梗多糖提取液与三氯乙酸正丁醇试剂按照体积比为 120 置于锥形瓶中混合，在 30下恒温振荡 30min，4000r /min 条件下离心 20min，弃去沉淀，得澄清液并测定蛋白质和多糖含量。 3.3 桔梗提取物含量的测定 3.3.1 桔梗多糖含量的测定 桔梗多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法 18测定桔梗多糖含量，以葡萄糖为 对照品。 配制标准溶液：精密称取 105干燥到恒重的葡萄糖标准样品 20mg,并置于 500ml容量瓶。 配制苯酚溶液：取苯酚 200g，加铝片 0.2g和碳酸氢钠 0.2g,蒸馏收集 182时的馏分，称取此馏分 10g,加水 150ml，置棕色瓶中，即得。 标准曲线的制作：精密吸取标准品溶液 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0ml，分别置于具塞试管中，各加蒸馏 水使总体积为 2.0ml,再分别加苯酚试液 1ml,摇匀，迅速滴加浓硫酸 5.0ml,摇 匀后放置 10min,置沸水浴中加热 15min,取出冷却至室温。在分光光度仪上于 490nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 用葡萄糖标准品溶液作为对照样测定不同浓度葡萄糖溶液的吸光度，作出 回归曲线，求出回归方程。待测样品液以同样的方法测吸光度，对照求值。 3.3.2 桔梗蛋白质含量的测定 桔梗蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法 19，以牛血清蛋白为标准品。 3.3.2.1 试剂的配制 0.9% NaCl溶液：取 0.9g NaCl溶于 1000ml水中。 标准蛋白液：牛血清蛋白（0.1mg/ml）,准确称取牛血清蛋白 0.1g，用 0.9% NaCl溶液溶解并稀释至 1000ml。 染液：考马斯亮蓝 G250(0.01%),称取 0.1g考马斯亮蓝 G250溶于 50ml 95% 乙醇中，再加入 100ml浓磷酸，然后加蒸馏水定容到 1000ml。 样品液：取牛血清蛋白（0.1mg/ml）溶液，用 0.9% NaCl稀释至一定浓度。 3.3.2.2 标准曲线的制备 取 7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。 混匀，室温静置 3min,以第一管为空白，于波长 595nm处比色，读取吸光度， 以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度标准曲线的制备(A 595nm) 管号 试剂 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白液/ml - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 0.9% NaCl/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 考马斯亮蓝染液 /ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质浓度 /(ug/ml) 0 10 20 30 40 60 80 3.3.2.3 样液的测定 另取一支干净试管，加入样品液 1.0ml及考马斯亮蓝染液 4.0ml,混匀，室 温静置 3min,于波长 595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲 线即可求出含量。 3.4 数据分析方法 所有数据利用 Excel 软件进行数据整理与绘图，采用 SPSS18.0 软件的 ONE- WAY 方法进行组间的差异性显著分析。 4 结果与分析 4.1 多糖含量测定标准曲线的建立 以葡萄糖为标准对照品，采用硫酸苯酚法测定法，建立多糖含量测定标准曲 线，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标。结果见图 1，有图可知，该 标准曲线的一次相关函数公式为：Y=14.642X+0.114，相关系数 R2=0.9723，说 明建立的该标准曲线能够用于本试验中多糖含量的检测。 y = 14.642x + 0.114 R2 = 0.9723 0 0.5 1 1.5 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 葡 萄 糖 浓 度 （ mg/ml） 吸光 值 图 1 多糖含量测定标准曲线图 4.2 蛋白质含量测定标准曲线的建立 以牛血清蛋白为标准对照品，采用考马斯亮蓝染色测定，建立蛋白质含量 测定标准曲线，以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标。结果见图 2，有 图可知，该标准曲线的一次相关函数公式为：Y=0.0048X+0.0213，相关系数 R2=0.9904，说明建立的该标准曲线能够用于本试验中蛋白质含量的检测。 y = 0.0048x + 0.0213 R2 = 0.9904 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 蛋 白 质 浓 度 （ ug/ml） 吸光 值 图 2 蛋白质含量测定标准曲线图 4.3 三个地区桔梗粗多糖含量的比较 三个地区桔梗粗多糖含量见表 1及图 3，由表可知，所提取的安徽太和桔 梗粗多糖含量最高，为 26.36%，其次为吉林延边桔梗，为 18.27%，最后为陕西 商洛桔梗，为 17.08%。安徽太和桔梗粗多糖显著高于陕西商洛和吉林延边 （P0.05）。 表 1 三个地区桔梗粗多糖含量表 陕西商洛 安徽太和 吉林延边 粗多糖含量% 17.081.56a 26.365.24b 18.273.35a 10 15 20 25 30 35 陕 西 商 洛 安 徽 太 和 吉 林 延 边 粗多糖 含量% 图 3 三个地区桔梗粗多糖含量 4.4 三个地区桔梗蛋白质去除率的比较 到目前为止，采用硫酸苯酚法将所提取的粗多糖进行除蛋白处理，结果 如表2及图4所示，陕西商洛桔梗的蛋白质去除率为68.08%，安徽太和的蛋白质 去除率为74.27%，吉林延边的蛋白质去除率为69.36%。安徽太和桔梗蛋白去除 率显著高于陕西商洛和吉林延边的桔梗（P0.05 ）。 表2 三个地区桔梗蛋白质去除率比较表 陕西商洛 安徽太和 吉林延边 粗多糖含量% 68.081.87a 74.272.15b 69.362.24a 60 65 70 75 80 陕 西 商 洛 安 徽 太 和 吉 林 延 边 蛋白 质去 除率 % 图4 三个地区桔梗蛋白质去除率 4.5 三个地区桔梗精制多糖含量的比较 采用硫酸苯酚法除去蛋白后，精多糖含量如表 3及图 5所示，由表可知 安徽太和最高为 15.42%，陕西商洛精多糖含量为 12.61%，吉林延边为 11.42%。安徽太和精多糖含量显著高于陕西商洛和吉林延边的桔梗（P0.05）。 表3 三个地区桔梗精制多糖含量比较表 陕西商洛 安徽太和 吉林延边 粗多糖含量% 12.610.64a 15.421.85b 11.421.12a 6 10 14 18 陕 西 商 洛 安 徽 太 和 吉 林 延 边 精多 糖含 量% 图5 三个地区桔梗精制多糖含量 5 结论与讨论 通过试验，苯酚-硫酸法测总糖含量是目前被广泛使用的一种经典方法, 它 适用于对单糖、寡糖以及均一多糖的含量测定。但不能排除还原性杂质( 包括 还原糖性的单糖) 的干扰，然而用之于总糖的测定具有重复性好，灵敏度高的 特点，而且该法省去了过柱子的繁琐，节约了时间。因此本文中采用该方法进 行多糖的测定是十分可行的。 桔梗多糖大多与蛋白质共存于某一部位，蛋白质或游离蛋白质的酸碱性氨 基酸常与多糖上的碱性或酸性基团产生静电结合使游离的蛋白质脱去产生难度。 为了提高桔梗多糖的生物活性，得到较高纯度的桔梗多糖，必须去除蛋白质。 目前，国内已有对于桔梗多糖的提取方面的报道，但尚未有标准方法。脱蛋白 常用的方法有传统的 Sevag 法、三氯醋酸法等，本研究使用实验室前期确定的 最佳的脱蛋白方法进行脱蛋白处理。采用三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白能够有效的 去除杂多糖中的蛋白质，并且能更好的降低多糖损失率。 本试验选取的三个地区的桔梗，粗多糖的含量以安徽太和为最高，陕西商 洛和吉林延边的次之。脱蛋白处理能够降低极大程度的去除粗多糖中的蛋白， 使多糖得到精制。由本试验的脱蛋白处理可以看出，安徽太和桔梗粗多糖中蛋 白含量较高，脱蛋白处理脱去了 74.27%的蛋白，陕西商洛的桔梗粗多糖中蛋白 含量较低，脱蛋白处理脱去了 68.08%的蛋白。经过脱蛋白处理后，精多糖含量 以安徽太和最高为 15.42%，陕西商洛精多糖含量为 12.61%，吉林延边为 11.42%。 6 参考文献 1国家药典委员会中华人民共和国药典(2010版) M北京：中国医药科技 出版社，2010：259-260 2王超，康立源中药多糖的药理学研究进展J世界科学技术中医药现 代化,2008，10(3)：8286 3 薛小玲. 商洛桔梗规范化生产技术标准操作规程J. 中国现代中药, 2008,10 (12):