rna 抽提及荧光定量pcr

RNA 抽提及荧光定量 PCR 试剂 RNAiso Plus （Takara， cat. no. 9109） 氯仿(国药) 异丙醇(国药) 75%乙醇（DEPC 水配制） DEPC（生工，cat.no. DB0154） DEPC 水：向超纯水中加入 DEPC 至终浓度 0.1%（v/v），搅拌过夜后，高温高压灭菌，以降解除 去 DEPC（DEPC 分解为 CO2 和乙醇）。Note ： DEPC 气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，毒性并不 是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，需在通风橱中操作。 M-MLV Reverse Transcriptase (RNase H+)（华大，cat.no. EM-004 ） Taq DNA Polymeras (tiangen，cat.no. ET101-02) SYBR Green I (百唯信) RQ1 RNase-Free DNase （Promega，cat.no.M6101） 操作步骤 RNA 抽提 1.实验样品的研磨和匀浆 A.贴壁培养细胞 去除培养液，用1*PBS清洗一次，加入适量RNAiso Plus（依据培养板的面积来决定所 需的RNAiso Plus量，每10 cm2加1 ml，即6-well plate的一个孔加1ml），使裂解液均匀分布于细胞表面，将 内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 B.悬浮培养细胞 离心收集细胞，加入适量 RNAiso Plus（每5-1010 6个细胞加1ml 的RNAiso Plus），枪 反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器破细胞壁。 C.组织样品 将组织在液氮中磨碎，每 50100mg组织加入1ml RNAiso Plus，用匀浆仪进行匀浆处理。 样品体积不应超过RNAiso Plus体积的10。 Note:1.所用 RNAiso Plus的量要适当，量多浪费，不足时可导致抽提的 RNA中污染有 DNA。 2.样品在 RNAiso Plus中不用担心 RNase 污染，可使用普通枪头和离心管，但之后的操作必须严格 使用 RNase-free的试剂、枪头和离心管，全程佩戴手套，注意防止污染。 3.匀浆后的样品可以在室温放置几个小时， -60至 -70可保存至少一个月。 4.用于提取 RNA的组织样品一定要新鲜，或是从 -80取出后立刻加液氮研磨，不可放置，否则 RNA会降解。 2.将匀浆样品在室温（1530）放置 5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，脂肪组织和植物结节部分等），可 于 4 12000g 离心 10 分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA，上清中含 有 RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除，取澄清的匀浆液进行下一步操作。 4. 加入氯仿（RNAiso Plus 的 1/5 体积量），剧烈振荡 15 秒，室温放置 5 分钟。 5. 412000g 离心 15 分钟。样品分为三层：无色的水相层（含 RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为 DNA）及红色的下层有机相。水相体积约为总体积的 50。 6. 把水相转移到新管中，切勿吸出白色中间层。（每 1ml RNAiso Plus 最多可以吸出 600ul 上清，为避免 DNA 污染，一般吸出 400ul-500ul 上清） 7. 加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置 10 分钟。 8. 412000g 离心 10 分钟，一般在离心后，试管底部会出现 RNA 沉淀。 9. 小心弃去上清, 切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与RNAiso Plus等量的75乙醇，轻轻上下 颠倒洗涤离心管管壁，7,500g 4离心5分钟后小心弃去上清，切勿触及沉淀。 Note： RNA沉淀在 75%酒精中可于 4保存一星期以上或 -20保存一年以上。 10.室温放置干燥沉淀，大约晾 510 分钟即可, 加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀。 Note：不可使 RNA 沉淀完全干燥，否则 RNA 将会很难溶解 , 部分溶解的 RNA 样品其 A260/280 比值 1.6。 逆转录合成 cDNA 有两种方法 1. 可选步骤：如果提要检测 DNA 病毒或是外源转染质粒的 RNA 表达情况，则需要用 DNase 处理去除病毒 或质粒 DNA。具体操作如下： A. 在 PCR 管中加入以下试剂： RNA x ul (=5ug) 10*RQ1 reaction buffer 0.5 ul RQ1 RNase-Free DNase 0.5 ul 加 DEPC 水至终体积 5 ul B. 37反应 30min C. 65失活 15min Note: 可直接在这一管子中加入相应试剂进行逆转录，因 10*RQ1 reaction buffer 中含有 100 mM MgSO4 , 可 能会影响逆转录酶的活性，用 DNase 处理后的 RNA 进行下一步逆转录实验时体积不宜超过 5ul。 两步法： 2. 在 PCR 管中加入以下试剂 RNA x ul (=5ug) Oligo (dT)20 primer(50 uM) 或 random primer (25-125 ng/ul) 2 ul 或基因特异引物 (2 pmol) dNTP (10mM each) 1 ul 加 DEPC 水至终体积 13.5 ul 3. 70保温 10 分钟后迅速冰浴 2-10 分钟。 4.加入以下反应液：20 的体系 5RT Buffer 4ul 0.1M DTT 2ul （DTT 即 DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。） RTase M-MLV 0.5ul 5.混匀后 42反应 60min 6. 70保温 15min 后冷却，即得到 cDNA 一步法：看具体 mix 说明书 PCR 仪的使用： 选 Block 选程序 开始 荧光定量 PCR PCR 反应体系: 上步中得到的 cDNA 溶液稀释 5 倍 ，上面是 20，则加 80 的 DDwater ， 稀释后的 DNA 5 ul 10*PCR buffer 2.5 ul dNTP（10 mM each） 0.5 ul Primer-F（10 M） 0.5 ul Primer-R（10 M） 0.5 ul SYBR Green 1 0.5 ul Taq DNA Polymeras 0.2 ul 加水至终体积 25 ul 除去 DNA，其他还有 20，20*（3*6+2）=400 ，多预留 2 个 Note: 1. 逆转录后的 cDNA 溶液做为模板加入量通常为 0.1-1ul（ 25ul 体系），过量会抑制 PCR 反应。为了 减少加样的误差，通常将得到的 20ul cDNA 溶液稀释 5-10 倍，加入 5ul 作为模板。 2. 引物设计基本原则与普通 PCR 一致，扩增产物 200500 bp 左右，最好能够跨两个外显子，尽量靠近 3端。 3. SYBR Green I 会抑制 Taq 酶活性，加入 SYBR Green I 后混匀，再加入酶。 实验室常用的 m