1.正交模拟法研究护骨胶囊各单味药及复方药效-贾欢欢

正交模拟法研究护骨胶囊各单味药及复方药效 贾欢欢 1 ，高建林 1 ，陈珺 1 ，卢丽 1 ，陆幸妍 1 ，杨国柱 1 ， 曾雯 2 ，秦中华 2 ，李英彬 1 ，万超 3 ，李青南 1* ( 1. 广东药学院，生命科学与生物制药学院，新药功能研究中心，广州 510006;2. 东莞万成制药有限公司，广东东莞523040; 3. 香港中文大学医学院， 生物医学学院，干细胞与再生医学中心，香港) 摘要 目的: 应用正交模拟法分析护骨胶囊( HG) 各药味对该复方药效的 贡献值，并对该方不同组合的复方进行药效模拟。 方法: 采用正交模拟法，将 HG 10 个药味按照设计的正交表分为13 个组( 第13 组为阴性对照组) ，通过 血清药理学实验得出相应含药血清，采用CCK-8 法检测各组血清对成骨细胞( Ob) 增殖的影响。DAS3. 0 软件处理数据，分析各药味的药效贡献值并对复方 药效进行模拟。结果: 以Ob 增殖为指标，经正交模拟法分析，确定HG 各药味 在复方中的药效贡献值顺序为: 淫羊藿 骨碎补 巴戟天 山药 龟甲 当归 熟地黄 续断 杜仲 制首乌; 以Ob 增殖为指标，对复方药效进行 模拟研究，结果显示27 个模拟组方预测药效值明显优于阴性对照组，而且原方 最好，4 个模拟组方接近于原方。 结论: 正交模拟法分析HG，确定了HG 各药 味在复方中的药效贡献值，并发现多个组方的模拟药效与原方接近。 关键词 正交模拟法; 护骨胶囊; 成骨细胞; 药效贡献值; 模拟药效 中图分类号R285. 5 文献标识码A文章编号1005-9903( 2011) 15- 0161-05 Pharmacodynamic Contributed Values of Composition and Pharmacodynamic Simulation of Compound Hugu Capsules by Orthogonal Simulation Method JIA Huan-huan1 ，GAO Jian-lin1 ，CHEN Jun1 ，LU Li1 ，LU Xing-yan1 ，YANG Guo-zhu1 ，ZENG Zhao-li2 ，ZENG Wen2 ，QIN Zhong-hua2 ，LI Ying-bin1 ，WAN Chao3 ，LI Qing-nan1* ( 1. School of Life Science and Pharmacopedia，Guangdong Pharmaceutical Universty，Guangzhou 510006，China; 2. Dongguan Wancheng Pharmacopedia Company Limited，Dongguang 523040，China; 3. Conter of Stem Cell and Regenerative Medicine，School of Biomedical Sciences，Faculty of Medicine，The Chinese University of Hong Kong，Shatin ，Hong Kong SAR，China) Abstract Objective: To analysis pharmacodynamic contributed values of composition and pharmacodynamic simulation of compound Hugu capsules ( HG) Method: Ten components of HG were divided into 13 groups ( group 13 for negative control group) by orthogonal simulation method，the drug serum was gotten by the serum pharmacological experiments and CCK-8 method was adopted to detect osteoblast ( Ob ) proliferationPharmacodynamic contributed values and pharmacodynamic simulation of compound were analysis by DAS3.0 software Result: The proliferation of Ob as a index，a sequence of pharmacodynamic contributed values were found by orthogonal simulation method: Epimedii Folium Drynariae Rhizoma Morindae Officinalis Radix Dioscoreae Rhizoma Testudinis Carapax et Plastrum Angelica Sinensis Radix Rehmanniae Radix Praeparata Dipsaci Radix Eucommiae Cortex Polygoni Multiflori Radix Praeparata Multiflorum F With Ob proliferation as the index，and the results of pharmacodynamic simulation of compound showed that 27 compounds were better than the negative control group，and the original compound is the best in effect，the other four compounds are close to the original compound Conclusion: Orthogonal simulation method is a method to analyze the Chinese herbal compound This approach can determine pharmacodynamic contributed values of composition，and pharmacodynamic simulation of compound for HG The method can provide a lot of information for studying Chinese herbal compound，and is benefit for developing new drug Key words orthogonal simulation method; Hugu capsules; osteoblast; pharmacodynamic contributed values; simulation efficacy 护骨胶囊( HG) 是在中医理论指导下形成的国家中药新药( 新药证书国药准字 Z20040106 ) ，临床研究表明其有很好的防治原发性骨质疏松症的作用 1 ， 但是临床反馈老年人用药量略微偏大，10% 的患者认为药性略微偏燥。为改善 这些不足，本文采用正交模拟法 2-3 分析HG 各药味对该复方药效的贡献值， 并对该方不同组合的复方进行药效模拟。该方法采用现代数理统计实验设计方 法及计算机技术，可确定各组分对复方药效的影响，排列其重要程度，并可以 对不同组合的效应进行预测。采用此方法使实验设计与研究更具合理性和科学 性，并以最少的实验次数得出尽可能最佳的实验结果 4 ，提高了实验的效率。 1 材料 1.1 动物 2月龄SD 大鼠 26 只，雌雄各半，体重( 200 10) g，合格证号 0074494 及0074528; 出生24h 内的SD 大鼠3 只，合格证号SCXK ( 粤) 2008- 0020，雌雄兼用，每只约15 g。均由广州中医药大学实验动物中心提供。 1.2 药材及试剂 护骨胶囊10味原药材( 东莞万成制药有限公司，批号均为 20100801) ，DMEM 高糖培养基( Gibco 公司，批号709791) 、0. 25% 胰酶溶 液 ( 中国医学科学院生物医学工程研究所，批号20100929 ) ，胶原酶 ( Invitrogen 公司，批号201108) ，PBS 缓冲液( 杭州吉诺生物医药技术有限 公司，批号20100914 ) ，-甘油磷酸钠( Sigma 公司，批号BCBB4821 ) ，L- 维生素C ( Sigma 公司，批号 037K02501) ，地塞米松( Sigma 公司，批号 100827) ，CCK-8 试剂盒( 碧云天生物技术研究所，批号C0038) ，碱性磷酸酶 ( AKP) 测定试剂盒( 南京建成生物工程研究所，批号20100630) 。 1.3 仪器 台式多管低速离心机( 长沙平凡仪器仪表有限公司，型号TDZ5-WS) ; 酶标仪( Bio-Rad 公司，型号Microplate Reader 680 ) ; 倒置生物显微镜 ( 深圳拓天仪器设备有限公司，型号J-D200 ) ; 二氧化碳培养箱( RSBiotech 公司，型号Galaxy) ; 恒温水浴锅( 中国姜堰市天力医疗器械有限公司，型号 TL420D) 等。 2 方法 2.1 护骨胶囊原方组成见表1。 表1 护骨胶囊原方组成 药 味 编 号 A B C D E F G H I J 药 味 淫羊 藿 巴戟 天 骨碎 补 杜仲 续断 制何 首乌 熟地 黄 龟甲 当归 山药 剂 量 /g 277.5 277.5 277.5 277.5 277.5 347.5 347.5 208.5 208.5 277.5 2.2 优化组方分组及给药剂量 HG 10 个组分A，B，C，D，E，F，G，H，I，J 按表2 进行设计，组成13 个组方，每个组方加8 倍量水浸泡1 h，分两次煎煮， 第一煎武火60 min，第二煎文火30 min5 。将两次粗虑的药液合并，抽滤， 收集滤液，最后浓缩到0. 1 gmL 1。每组2 只大鼠给药，雌雄各半。按0. 2 mL kg 1 进行ig，每天1 次，连续7 d。根据护骨胶囊人的服用量计算出护骨胶 囊原药材的大鼠给药量，采用标准动物的等效剂量折算系数法 6 ，可以折算 出 每组大鼠的给药量，其计算方法为: 大鼠给药剂量( gkg 1 ) = 人的临床剂量( gkg1 ) 70 kg 0. 018 /0. 2 kg = 6. 3 人的临床剂量( gkg1 ) 。其中0. 018 为折算系数; 人体重按70 kg计算，大鼠体重按0. 2 kg 计算。HG 人的临床给药量1 天为: 0. 476 gkg 1 。计算结果见表3。其中阴性对照组13 大鼠ig 0. 9% 的生理 盐水。 2.3 含药血清制备 最后1 次ig 后1h心脏取血，将大鼠血3 000 rmin1 离 心10min ，取血清，每组血清混匀，于56 水浴30 min 灭活， 20 保 存。配制时采用0. 22 m 的微孔滤膜过滤，与无血清的DMEM 配成10% 的含药 血清培养基。 表2 正交设计 配伍 组号 A B C D E F G H I J 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 2 2 2 2 2 1 3 1 1 2 2 1 2 1 2 1 2 4 1 2 2 1 2 1 1 2 2 1 5 1 2 2 2 1 1 2 1 2 2 6 1 2 1 1 2 2 2 1 1 2 7 2 1 1 2 2 1 1 1 2 2 8 2 1 2 1 2 1 2 2 1 2 9 2 1 2 1 1 2 2 1 2 1 10 2 2 1 1 1 2 1 2 2 2 11 2 2 1 2 1 1 2 2 1 1 12 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 13 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 注: 1 水平代表用药，2 水平代表不用药。 表3 各组具体给药剂量 配伍组 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 给药剂 量 /gkg 1 3.0 1.2 1.5 1.6 1.2 1.4 1.6 1.2 1.5 1.3 1.5 1.2 0.0 2. 4 成骨细胞( osteoblasts，0b) 培养 出生24 h 内的SD 大鼠，75% 乙醇 浸泡15 min，无菌取头盖骨，PBS 液中刮去结缔组织及骨膜，直至骨头发白， 重复清洗3 次，用2% 的胶原酶消化，形成原代成骨细胞。用含10% FBS 的 DMEM 在37 ，5% CO2条件下培养成骨细胞，3d 后更换培养基。待细胞长到大 概培养皿90% 以上进行传代 7 。 2.5 细胞增殖实验 将对数生长期的细胞胰蛋白酶消化后，用含10% 胎牛血清 培养基稀释至1104 /mL。混匀接种于96 孔培养板中，每孔100L细胞液，3 7 ，5% CO2培养箱中培养1d。而后吸去旧培养基，加入配制的10% 含药血清 培养基，37 ，5% CO 2培养箱中培养2d。2d后向每孔加入10L的CCK-8 溶液， 继续在37 ，5% CO2培养箱中培养1 h，用酶标仪在470 nm 测定吸光度( A) 8 。 2.6 数值分析 本实验用正交模拟法对 HG 进行研究，采用2 个水平考察，1 水平为“使用该药”，2 水平为“不使用该药”; 用双向单侧t 检验分析各组 分 在复方中的重要程度; 提出了复方药效学模型。此法可确定各组分对复方药效 的贡献值，排列其重要程度，并可对不同组合的复方进行药效模拟 3 。所有 实验数据以珋x s 表示。方差分析、双向单侧t检验，药效预测，均由DAS 3.0 软件完成。 3 结果 3.1 Ob 鉴定 3.1.1 形态学观察 原代细胞贴壁前呈均匀一致的球形，24 h 左右开始贴壁， 72 h 完全贴壁，并且胞浆伸展，呈饱满的多角形。10 d 之后出现细胞融合， 大多呈立方体形。 3.1.2 碱性磷酸酶( AKP) 检测 条件培养基可以诱导头盖骨骨髓间充质干细 胞转化为成骨细胞，以AKP 试剂盒检测，发现使用条件培养基培养细胞的上清 液A 值 0. 164 0 0. 003，明显高于使用普通培养基的A 值0.0343 0.002 1( P 0.05) 。 3.2 HG 模拟组方对成骨细胞增殖的影响 与阴性对照组( 第13 组) 比较， 第1 组及第 2组A值较高，有统计学差异( P 0. 05) ，且第1 组A 值明显高 于 第2 组。见表4。 表4 优化组方分组10%含药血清 培养成骨细胞2 d 后测470 nm A( 珋x s，n = 3) 配伍组号 A RSD/% 1 0.87130.17231) 19.8 2 0.56800.06461) 11.4 3 0.45470.0193 4.3 4 0.40700.0225 5.5 5 0.43430.0340 7.8 6 0.48530.0274 5.7 7 0.42700.0142 3.3 8 0.36700.0050 1.4 9 0.39170.0133 3.4 10 0.38030.0206 5.4 11 0.37970.0084 2.2 12 0.39230.0155 4.0 13 0.43230.0504 11.6 注: 与阴性对照组( 第13 组) 比较1) P 0. 05，RSD 为相对标准差。 3.3 药效学参数分析 应用 DAS3. 0 软件分析13个组的A 值，比较各药味“用 药”与“不用药”的药效变化，确定各药味的重要性，实为该组分对复方的贡 献值，反映各自重要程度 3 。见表5。由表5 可以发现: 所有药物对Ob 增殖 均有加强的作用，其中D，F 对Ob 增殖作用不明显。而且可以得出各味药对Ob 增殖的影响大小，也是重要程度排序为: A C B J H I G E D F，即: 淫羊藿A 骨碎补C 巴戟天B 山药J 龟甲H 当归I 熟地黄G 续断E 杜仲D 制首乌F。 表5 各组分对复方药效的贡献值ED 参数项 药效贡献值 ED 相对标准误 RSE t P 注释 E(0) 0.4323 0.0673 基线效应 E(A) 0.1410 0.1491 6.7060 0.0000 期望贡献值 E(B) 0.0974 0.2160 4.6300 0.0000 期望贡献值 E(C) 0.1073 0.1960 5.1010 0.0000 期望贡献值 E(D) 0.0426 0.4938 2.0250 0.0500 期望贡献值 E(E) 0.0455 0.4624 2.1630 0.0370 期望贡献值 E(F) 0.0375 0.5603 1.7850 0.0830 期望贡献值 E(G) 0.0519 0.4054 2.4670 0.0180 期望贡献值 E(H) 0.0733 0.2868 3.4870 0.0010 期望贡献值 E(I) 0.0573 0.3667 2.7270 0.0100 期望贡献值 E(J) 0.0758 0.2774 3.6050 0.0010 期望贡献值 3.4 复方药效学模型评价 复方药效预测( Epred)是在不含相互作用的期望效 应( Eexp) 基础上，考虑了药物间相互作用效应( Eint) 及个体值与均值之间 随机波动( Erand) 的综合结果 3 。其计算公式为:复方药效预测= 期望效应+ 相互作用效应+ 随机波动应用DAS3.0 软件对HG不同组合的复方进行药效模拟评 价，通过药效预测值Epred 发现，28 个预测组中最小效应组合为组3 ( Epred: 0. 4323 ) ，即阴性对照组; 最大效应组合为组1 ( Epred: 1.162 ) ，即原方。 其次有4 个组合的模拟药效值接近于原方:组6( Epred: 1.0407) 含8 味药，减 少了续断E、山药J; 组8 ( Epred: 1.0436 ) ，含8 味药，减少了杜仲D、山药 J; 组19( Epred: 1.0861) 含9 味药，减少了山药J; 组23( Epred: 1.0060) 含7 味药，减少了杜仲D、制何首乌F、山药J。结果见表6。 表6 不同组方的药效预测值及其95%置信区间的模拟( s，n = 12)x 组别 组方方案 药效预测 95%置信下 限 95%置信上 限 1 A1B1C1D1E1F1G1H1I1J1 1.1620 1.0907 1.2332 2 F1 0.4699 0.4059 0.5339 3 A2B2C2D2E2F2G2H2I2J2 0.4323 0.3611 0.5036 4 A1C1D1E1F1G1 0.8581 0.7676 0.9486 5 G1H1I1 0.6149 0.5281 0.7016 6 A1B1C1D1F1G1H1I1 1.0407 0.9614 1.1199 7 B1C1D1E1F1G1I1 0.8718 0.7642 0.9794 8 A1B1C1E1F1G1H1I1 1.0436 0.9648 1.1223 9 A1B1D1E1F1G1 0.8482 0.7552 0.9411 10 A1B1C1E1G1I1 0.9327 0.8550 1.0103 11 B1C1D1F1G1I1 0.8263 0.7251 0.9276 12 B1C1D1E1F1H1 0.8359 0.7363 0.9355 13 A1B1C1D1E1H1I1 0.9967 0.9197 1.0737 14 A1C1D1E1G1 0.8206 0.7366 0.9045 15 A1C1D1F1G1I1 0.8700 0.7810 0.9589 16 A1C1D1H1I1 0.8539 0.7744 0.9334 17 A1C1D1F1G1H1 0.8860 0.7997 0.9722 18 A1B1C1D1E1 0.8661 0.7900 0.9421 19 A1B1C1D1E1F1G1H1I1 1.0861 1.0055 1.1668 20 A1B1C1E1F1G1 0.9129 0.8325 0.9932 21 A1D1E1F1G1H1I1 0.8815 0.7793 0.9836 22 C1D1E1F1G1H1I1 0.8478 0.7352 0.9603 23 A1B1C1E1G1H1I1 1.0060 0.9306 1.0815 24 A1B1C1D1F1H1I1 0.9888 0.9107 1.0669 25 B1C1E1F1H1I1 0.8507 0.7527 0.9486 26 A1B1C1D1E1G1I1 0.9753 0.8937 1.0568 27 A1B1C1D1E1F1G1 0.9555 0.8709 1.0400 28 B1D1E1F1G1H1I1 0.8378 0.7229 0.9528 4 讨论 近年来，随着人口的老龄化，骨质疏松症已被列为国家重点攻关的老年三 大疾病之一 9 。中药护骨胶囊在治疗骨质疏松症方面已取得了一定的临床疗 效，但该方临床反馈药性略微偏燥，用药量稍大。为改善这些不足，本研究采 用正交模拟法分析了HG10 味药的多种配伍组合及各味药对复方的药效贡献值。 结果得出了HG 各药味对复方药效的贡献值，并排列了其重要程度 : 淫羊藿A 骨碎补C 巴戟天B 山药J 龟甲H 当归I 熟地黄G 续断E 杜仲D 制何首乌F。其中淫羊藿的药效贡献值远大于其他药味的贡献值，进 一步证明了淫羊藿作为护骨胶囊君药的科学性。本实验同时对不同组合的复方 进行了药效模拟，发现28 个预测组中最小效应组合为组3，即阴性对照组; 最 大效应组合为组1，即原方; 其次有4 个组合的模拟药效值接