相萃取技术讲义奥秘科技固相萃取法培训教程课件

固相萃取法讲义 卢志浩 奥秘科技有限公司 客服： 0531-8856-3956 一、概述 所谓萃取法 ,就是从样品中提取组分 ,传统的方 法是液 -液萃取法 ( LLE) ,即用液体作为提取剂。 固相萃取（ Solid Phase Extraction, SPE） 是 19世纪 70年代后期发展起来的样品前处理技术。它发展迅 速，广泛应用于环境、制药、临床医学、食品等领 域 。 固相萃取（ SPE）是利用固体吸附剂将样品中的 目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分 离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的 目的。先使样品通过一装有吸附剂（固相）小柱 ，保留其中某些组分，再选用适当的溶剂冲洗杂 质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分 离净化与浓缩的目的。 一、概述 与液液萃取相比，固相萃取具有如下优点： 回收率和富集倍数高 有机溶剂消耗量低，可 减少对环境的污染 采用高效、高选择性的吸附 剂，能更有效的将分析物与干扰组分分离 无相 分离操作过程，容易收集分析物 能处理小体积 试样 操作简便、快速，费用低，易于实现自动 化及与其他分析仪器连用。 一、概述 样品类型 SPE可以用于所有类型样品的处理，但是液体 样品是最容易处理的。 Survey response % 二、固相萃取的基本原理、分离 模式及操作步骤 1.固相萃取的基本原理 固相萃取的基本原理是样品在两相之间的分配，即在固相 （吸附剂）和液相（溶剂）之间的分配。 固相萃取保留或洗脱的机制取决于被分析物与吸附剂表面 的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子作用力。 洗脱模式有两种：一种是目标化合物比干扰物与吸附剂之 间的亲和力更强，因而被保留，洗脱时采用对目标化合物 亲和力更强的溶剂；另一种是干扰物比目标化合物与吸附 剂之间的亲和力更强，则目标化合物被直接的洗脱。通常 采用前一种洗脱方式。 2.固相萃取的分离模式 反相固相萃取 正相固相萃取 离子交换萃取 免疫亲和 有机溶剂非极性顺序 正己烷 环己烷 四氯化碳 甲苯 苯 无水乙醚 氯仿 二氯甲烷 四氢呋 喃 乙酸乙酯 丙酮 乙腈 异丙醇 甲 醇 水 乙酸 反相固相萃取 反相：吸附剂（固定相） 是非极性或弱极性 的，如 硅胶键合 C18,C8, C4， C2,-苯基等。流动相为极性 （水溶液）或中等极性样品基质。 吸附剂的极性小于洗脱液的极性。 应用：可以从强极性的溶剂中（如水样）萃取 是非 极性或弱极性 的化合物。 作用机理：非极性 -非极性相互作用，如范德华力 或色散力。 正相固相萃取 吸附剂： 极性键合相， 如 硅胶键合 NH2、 CN， -Diol（二醇基）； 极性吸附剂 ，如 silica、 florisil、 (A-,N- ,B-)alumina、硅藻土 等。流动相为中等极性到非极性样 品基质。 作用机理： 1）极性 -极性相互作用 2）表面硅羟基、铝羟基与极性化合物的极性官 能团之间相互作用，包括氢键， -键等。 3）偶极 -偶极相互作用 4） 偶极 -诱导偶极相互作用 应用：从非极性溶剂样品 中萃取极性 化合物 硅胶柱 (silica) 表面 SiOH,中等强度的吸附剂，适用于从非极性基体中吸附极性化合 物。 硅胶是一种酸性吸附剂，可以吸附酸性（有机酸类）或中性的极性化合 物，由于表面的硅醇基可以释放出弱酸性的氢离子，又作为一种弱酸性 阳离子交换剂，吸附碱性化合物（生物碱类，胺类）。 活性（吸附性）与硅胶的含水量有关，根据其中含水量不同分为不同的 活性等级。 硅胶的活化：加热到 100-110度，除去表面吸附的水份，当温度升到 500 度，表面的硅醇基脱水变成硅氧烷键，从而丧失吸附性。 硅胶极亲水： 分析的样品溶液必须无水 。 备注：硅胶净化时，一般杂质保留在柱上，目标化合 物流出。 离子交换固相萃取 离子交换固相萃取用于萃取分离带有电荷的分析 物 固定相为带电荷的离子交换树脂，流动相为中等 极性到非极性样品基质。 分析物与吸附剂间的作用是静电吸引力。 离子交换固相萃取分为阴离子交换固相萃取和阳 离子交换固相萃取。 免疫亲和 即将抗体偶联到固相载体而制成免疫亲和层析柱，可 对样品中能与抗体结合的特异性抗原分子进行分离、 纯化。 例：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从 血清 中 分离其对应的抗体。金黄色葡萄球菌蛋白 A（ ProteinA）能够与 免疫球蛋白 G（ IgG）结合，可以用 于分离各种 IgG。 三、固相萃取的操作步骤 一个完整的固相萃取步骤包括固相萃取柱的预处 理、上样、洗去干扰物质、洗脱及收集分析物四 个步骤。 a.固相萃取柱的预处理 一是为了润湿和活化固相萃取填料，二是为了除去填料中可能存在 的杂质，减少污染。 采取的方法是用一定量溶剂冲洗萃取柱。 方法： 反相类型的固相萃取硅胶和非极性吸附剂介质，通常用水溶性有机 溶剂如甲醇预处理，然后用水或缓冲溶液替换滞留在柱中的甲醇 。 正相类型的固相萃取硅胶和极性吸附剂介质，通常用样品所在的有 机溶剂来预处理。 离子交换填料一般用 3 5mL 去离子水或低浓度的离子缓冲溶液来 预处理。 注意事项： 固相萃取填料从预处理到样品加人都应保持湿润，如果在 样品加人之前，萃取柱中的填料干了，需要重复预处理过程。 b.上样 将样品倒入活化后的 SPE 小柱，然后利用加压、抽 真空或离心的方法使样品进入吸附剂。采取手动或 泵以正压推动或负压抽吸方式，使液体样品以适当 流速通过固相萃取柱，此时，样品中的目标萃取物 被吸附在固相萃取柱填料上。 b.上样上样 d.洗脱及收集分析物 选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱 液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。 c.洗去干扰物质 目的是为了除去吸附在固相萃取柱上的少量 基体干扰组分 。 一般选择中等强度的混合溶剂，尽可能除去 基体中的干扰组分，又不会导致目标萃取物 流失。 例如： 反相萃取体系常选用一定比例组 成的有机溶剂 -水混合液，有机溶剂比例应大 于样品溶液而小于洗脱剂溶液。 四、固相萃取基本装置 固相萃取的基本装置包括固相萃取柱和固相萃取过 滤装置。固相萃取柱是整个固相萃取装置的核心 。 （ 1）固相萃取柱 商品化的固相萃取柱（ cartridge）外形类似于一个 注射器针筒。还可自行填装固相萃取柱。 （ 2）固相萃取过滤装置 固相萃取加样过程中，需通过适当的方法使样品 溶液通过固相萃取柱，使待分析物吸附在填料上 。洗脱过程中，同样需要使溶剂通过固相萃取住 ，使待分析物解析。以上步骤需借助于固相萃取 过滤装置完成，采用柱前加压或柱后加负压抽吸 的方式实现。 a.固相萃取过滤 -加压操作 固相萃取加压操作可通过 在液体样品储液槽上方用 高压空气或氮气施加一定 压力来实现的。如果样品 较少，可以用手动加压的 方式实现。 美国 Supelco公司提供的 给单个固相萃取小柱加 压的单管处理塞。 b. 固相萃取过滤 -负压抽吸 负压抽吸是在固相萃 取柱的出口用注射器 手动抽负压，或与水 泵或真空泵相连，用 泵施加适当真空度， 从而使样品溶液抽吸 通过固相萃取柱。最 常用的是用抽滤瓶实 现负压抽吸。 也可以采用固相萃取过滤装置同时处理多个样品 c. 固相萃取过滤 -离心法 全自动固相萃取仪 全自动固 相萃取仪 能自动完 成固相萃 取的全部 步骤 固相萃取联用装置 四、固相萃取方法的建立及应用 固相萃取吸附剂的选择 固相萃取溶剂的选择 固相萃取的应用 1.固相萃取吸附剂的选择 -固 相萃取吸附剂的原则 固相萃取吸附剂最好为多孔的、具有大的表面积的 固体颗粒。 固相萃取吸附剂应有较低的空白值。 萃取吸附过程必须可逆且有高的回收率。 固相萃取吸附剂要有高的化学稳定性。 固相萃取吸附剂必须与样品溶液有好的界面接触 。 常用固相萃取吸附剂 键和硅胶吸附剂 石墨碳 离子交换树脂 金属配合物吸附剂 聚合物吸附剂 免疫亲和吸附剂 分子嵌入聚合物 键和硅胶吸附剂 常用的键合硅 胶吸附剂表面 积在 50 500m2/g 之间 ，孔径为 5 50nm ，粒径 大于 40m 。 一般应选择粒 径小、比表面 积大的吸附剂 ，以获得更好 的萃取效果。 但要注意若粒 径过细，萃取 时阻力增加， 萃取速度下降 。 1.固相萃取吸附剂的选择固相萃取吸附剂的选择 应根据分析对象、检测手段及实验室条件合理选择 。 2.固相萃取溶剂的选择 在固相萃取固定相活化、上样富集、淋洗杂质、分 析物洗脱过程中，都涉及到溶剂选择问题。 a.固定相活化溶剂的选择 一般使用两种活化溶剂。第一种溶剂（初始溶剂 ）用于净化固定相，对于常用的 C18键和硅胶固 定相，可用甲醇有效地除去其所含杂质。第二种 溶剂（终溶剂）使固定相溶剂化，以便样品中的 分析物能更好的保留。 b.淋洗溶剂的选择 淋洗溶剂用于洗去吸附在固定相上的干扰组分 。淋洗溶剂的强度选择非常重要，其强度不能 太高，也不能太低，应大于或等于上样溶剂， 又小于洗脱溶剂。淋洗溶剂的选择原则：尽可 能将干扰组分从固定相上洗脱完全，但又不能 洗脱任何分析物。 d.洗脱溶剂的选择 溶剂强度应足够大，以保证吸附在固定相上 的分析物定量洗脱下来。 选择的洗脱溶剂应与后续的分析相适应。 选择粘度小、纯度高、毒性小并与分析物和 固定相不发生反应的溶剂。选择单一溶剂效 果不理想时，可以考虑使用混合溶剂进行洗