蛋白质组学LDHppt课件

蛋白质组学 Proteomics 1 p 蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生 命活动的实际执行者。 p 几乎所有的生物催化剂 -酶，都是蛋白质。构成 细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白 质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨 ；肌肉大部分也是由蛋白质组成。 p 蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链， 肽链再折叠形成一定空间结构。 前言与背景 2 100,000 proteins 3 billion bases 28,000 genes 人类基因组中绝大部分基因及其功能有 待于在蛋白质水平上加以揭示与阐述。 3 4 5 基因组 转录组 蛋白质组 6 The era of omics-based science （ 组学时代 ） Genomics （ 基因组学 ） Post-genomic science （ 后基因组时代 ） Functional genomics （ 功能基因组学 ） Transcriptomics（ 转录组学 ） Proteomics （ 蛋白质组学 ） Metabonomics/metabolomics （ 代谢组学 ） Structural genomics （ 结构基因组学 ） Aim - 3D structures of all protein folds ! 7 基因组告诉你，理论上能够发生什么？ mRNA告诉你，可能发生什么？ 蛋白质组告诉你，正在发生什么？ 8 蛋白质组（ proteome） ： 1994年，由 Marc Wilkins首次提出，指由 一个基因组 (genOME)，或一个细胞、组 织表达的所有蛋白质 (PROTein)。 3.1.2 蛋白 质组 9 蛋白质组学（ proteomics）： 以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态 变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰 状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系 ，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控 的活动规律。 3.1.3 蛋白 质组 学 10 功能蛋白质组： 细胞在某一阶段或与某一 生理现象相关的所有蛋白质。 差异蛋白质组： 不同种类或状态下各种样 本之间蛋白质组的区别与变化 。 11 3.2 蛋白 质组 学的研究 多样 -蛋白质数目大大超过基因数目。 可变 -蛋白质随时间与空间变化。 12 3.2.1 蛋白 质组 学研究的基本流程 13 基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广 泛的、发展最为成熟的工作流程 2-DE & MS 14 15 样品制备 样品来源：细胞、组织、体液等。 可采用全蛋白； 或进行预分级（线粒体、高尔基体、叶绿体、 膜蛋白、核蛋白等） - 提高低丰度蛋白质的上 样量及检测灵敏度。 p 尽可能扩大 蛋白质的 溶解度和解聚，以提高分 辨率。 16 样品分离 双向凝胶电泳（ two-dimensional electrophoresis, 2-DE） ：利用蛋白质的 等电点与分子量差异分离之。 第一向：等电聚焦 IEF 第二向： SDS-PAGE 17 18 第一向 等电聚焦 IEF 19 20 第二向 SDS-PAGE 21 染色方法 考马斯亮蓝染色 银染（不含戊二醛） 荧光染色（ Cy3, Cy5），放射性同位素标 记等 22 23 24 25 2-DE 的缺点 难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极 小蛋白质，及低丰度蛋白质。 胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自 动化联用。 26 新型非凝胶技术 液相色谱法（ liquid chromatography, LC ） 对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、 低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋 白进行有效的分离鉴定 。 LC-MS/MS：液质联用技术 27 Cell culture Protein extraction 2-DE staining Image analysis Scanning 28 微量 测 序（ microsequencing） N-末端 Edman 降解 ： 经凝胶分离的蛋白质直接 印迹在 PVDF膜或玻璃纤维膜上 N末端氨基酸 残基经苯异硫氰酸酯修饰 从多肽链上切下修饰 的残基 再经层析鉴定 余下的多肽链被回收 再进行下一轮降解循环。 缺点：过程 缓慢，消耗大 ， 试剂昂贵 。 29 质谱分析（ Mass spectrometry） 基本原理： 样品分子离子化后，根据离子 间质荷比（ m/z）差异来分离并确定样品分 子量。 30 Inlet Ionization Mass Analyzer Mass Sorting (filtering) Ion Detector Detection Ion Source Solid Liquid Vapor Detect ions Form ions (charged molecules) Sort Ions by Mass (m/z) 1330 1340 1350 100 75 50 25 0 Mass Spectrum 31 主要质谱类型 MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解吸 /电离飞行时 间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) ESI MS: 电喷雾质谱 （ electrospray ionisation mass spectrometry ） 32 MALDI l 利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基 质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一 步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。 33 34 35 36 l MALDI 最大的特点是离子电荷通常为 1-2个， 而不象 ESI中为多电荷离子，对分子质量较大的样 品而言，不会形成复杂的多电荷图谱，因而对图 谱的解析比较清楚 。 37 ESI 待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口 。在高电压作用下形成带电荷的雾滴，随着雾滴中溶剂的蒸发 ，其表面电场随半径减少而增加，电荷密度不断变大，到达某 一临界点时，样品以离子方式蒸发进入气相，从而实现离子化 。 38 l 没有直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较 少，是一种典型的 “软电离 ”方式。 l 可形成多电荷离子，因此在较小的 m/z范围内可以检测到大 分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质 量 100 kDa以下的蛋白质，最高可达 150 kDa。 l由于采用液相方式进样，可与蛋白质化学中常用的液相色谱 联用，即液相色谱 -电喷雾质谱 (LC-ESI MS)。 l在常规电喷雾质谱中，喷雾的过程易形成较大液滴，液 滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化，从而降低 了样品的利用率和灵敏度。 电喷雾源 (ESI)的特点 39 鉴定与注释蛋白质的路线 通过肽指纹图谱（ peptide mass fingerprint, PMF）和数据库搜寻匹配 通过检测样品中部分肽段的二级质谱信息 或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 MALDI-TOF/TOF LC-MS/MS 40 41 42 PMF +TOF MS: 180 MCA scans from Serum T 040703.wiff Max. 201.0 counts. 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 25000 10 20 30 40 50 60 70 80 95 Intensity, counts 1465.6373 1206.5765 1913.9160 1503.6072 1434.5226 2178.9336 1552.6042 1169.5336 1951.8651 43 MS-MS 1205 44 MS-MS 1465 45 MS-MS 1913 46 蛋白质数据库 目前应用最普遍的数据库是 NRDB 和 dbEST 数据 库。 NRDB 由 SWISS-PROT 和 GENPETP 等几个数据库组成 ； dbEST是由美国国家生物技术信息中心（ NCBI）和 欧 洲生物信息学研究所 (EBI)共同编辑，包括大量肽序列标 签（ PST）。 SWISS-PROT () 拥有目 前世界上最大的蛋白质组学数据库。 47 PMF或二级质谱匹配检索常用搜索引擎 - MASCOT () 48 3.3 蛋白 质组 学研究平台 抗体芯片 可用于 研究在不同生理状态或病理状态下蛋 白水平的量变 。 49 优点： 微型化，集成化，高通量化。 如肿瘤标志物抗体芯片等 50 内源标准化处理 常用荧光标记： Cy5和 Cy3等。 51 酵母双杂交系统（ Yeast two-hybrid system） 典型的真核 转录 因子都含有二个 结 构域 : DNA结 合 结 构域 （ DNA binding domain， DNA-BD） 和 转录 激活 结 构域 （ activation domain， AD） 。 二个 结 构域功能上相互独立又互相依 赖 ，只有 结 合才具完整活性。