毒理基因组学与系统毒理学 ppt课件

毒理基因组学与毒理基因组学与 系统毒理学系统毒理学 Toxicogenomics and system toxicology 1 内容概要内容概要 n 第一节第一节 概述概述 n 第二节第二节 毒理基因组学研究的技术平台毒理基因组学研究的技术平台 n 第三节第三节 毒理基因组学研究的内容及其毒理基因组学研究的内容及其 应用应用 n 第四节第四节 从毒理基因组学到系统毒理学从毒理基因组学到系统毒理学 2 目的要求目的要求 n 掌握掌握 毒理基因组学相关概念毒理基因组学相关概念 n 熟悉熟悉 毒理基因组学研究的内容及其应用毒理基因组学研究的内容及其应用 n 了解了解 毒理基因组学研究的平台毒理基因组学研究的平台 3 毒理基因组学 (toxicogenomics) 研究生物体的整个 基因组 如何对 环境有害因素 发生反 应的一门新兴学科。 基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、遗传 多态性、生物信息学 多学科交叉的前沿学科 第一节 概述 4 人类基因组计划人类基因组计划 HGP n HGP由美国科学家于由美国科学家于 1985年率先提出，于年率先提出，于 1990年正式启动的。美国、英国、法国、年正式启动的。美国、英国、法国、 德国、日本和我国科学家共同参与德国、日本和我国科学家共同参与 n 为为 30多亿个碱基对构成的人类基因组精确多亿个碱基对构成的人类基因组精确 测序，破译人类全部遗传信息测序，破译人类全部遗传信息 5 HGP n 目的目的 :解码生命、了解生命的起源、了解生解码生命、了解生命的起源、了解生 命体生长发育的规律、认识种属之间和个命体生长发育的规律、认识种属之间和个 体之间存在差异的起因、认识疾病产生的体之间存在差异的起因、认识疾病产生的 机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病 的诊治提供科学依据的诊治提供科学依据 n 内容：内容： 建立物理图谱建立物理图谱 建立遗传图谱建立遗传图谱 DNA序列测定序列测定 基因的确定和分析基因的确定和分析 6 后基因组时代（后基因组时代（ post-genome era） n 人类后基因组计划人类后基因组计划 -对基因组生物学功能的研对基因组生物学功能的研 究和应用究和应用 n 序列（结构）基因组学序列（结构）基因组学 -功能基因组学功能基因组学 功能基因组学 生物信息学 比较基因组学 结构基因组学 蛋白组学 生物信息学 DNA芯片 基因敲除 药物基因组学 环境基因组学 毒理基因组学 7 环境基因组学（环境基因组学（ Environmental genomics） n 探讨环境探讨环境 -基因，基因基因，基因 -基因间的交互作用基因间的交互作用 n 目标：目标： 研究遗传变异如何影响机体对环境因素作研究遗传变异如何影响机体对环境因素作 用的反应，包括发掘环境反应基因的多态性，评用的反应，包括发掘环境反应基因的多态性，评 价这些多态性的功能及其与患病风险的关系价这些多态性的功能及其与患病风险的关系 8 环境基因组计划（ Environmental genomics project, HPG） n 美国国立环境卫生科学研究所（美国国立环境卫生科学研究所（ NIEHS），）， 1998年年 n 目的：归纳整理人类基因组的多态性，并目的：归纳整理人类基因组的多态性，并 将这些信息用于研究机体对环境暴露的反将这些信息用于研究机体对环境暴露的反 应性和对疾病的易感性的差异。应性和对疾病的易感性的差异。 9 n 利用人类基因组的资料，帮助筛选和鉴利用人类基因组的资料，帮助筛选和鉴 别潜在的环境毒物，并在基因组水平上别潜在的环境毒物，并在基因组水平上 阐明毒作用发生的机制。阐明毒作用发生的机制。 毒理基因组学的基本任务毒理基因组学的基本任务 10 n 近期目标近期目标 ： 是确定某种有害因素的反应基是确定某种有害因素的反应基 因（信号基因）用于毒理学和相关疾病的因（信号基因）用于毒理学和相关疾病的 研究。研究。 n 远期目标远期目标 ： 建立全基因组与蛋白质组毒性建立全基因组与蛋白质组毒性 反应知识库，并在此基础上开辟以反应知识库，并在此基础上开辟以 芯片技芯片技 术术 和和 生物信息技术生物信息技术 为特征的为特征的 数字毒理学数字毒理学 （ digitized toxicolgy） 毒理基因组学的研究目标 11 National Center for toxicogenomics ， NCT 的主要任务的主要任务 n 促进基因和蛋白表达技术在毒理学中的促进基因和蛋白表达技术在毒理学中的 应用；应用； n 促进人类环境暴露和疾病易感性关系的促进人类环境暴露和疾病易感性关系的 研究；研究； n 确定暴露和毒效应的生物标志；确定暴露和毒效应的生物标志； n 推进暴露与生物学反应关系的计算和处推进暴露与生物学反应关系的计算和处 理方法；理方法； n 建立毒理基因组学的公用数据库。建立毒理基因组学的公用数据库。 12 n 高通量筛选系统 计算机数据处理计算机数据处理 第二节 毒理基因组学研究的技术平台 获取大规模生物学数据， 包括基因组、转录组、 蛋白质组和代谢组 表达数据 对大量信息进行 及时而合理的处理 基因表达数据 经典毒理学试验资料 13 一、基因组学与转录组学技术平台一、基因组学与转录组学技术平台 （一）差异显示反转录（一）差异显示反转录 PCR技术（技术（ DDRT-PCR） n PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础 n 总总 RNA-cDNA- PCR -DNA测序胶测序胶 n 目的：目的： 找出表达有差异的找出表达有差异的 cDNA片段片段 14 DDRT-PCR特点特点 n 优点优点 周期短周期短 功能多功能多 灵敏度高灵敏度高 所需所需 RNA量少重复量少重复 性高性高 所获得的所获得的 cDNA 仅代表仅代表 mRNA 3非翻译区非翻译区 n 缺点缺点 假阳性率高假阳性率高 ；凝胶中单条；凝胶中单条 cDNA带成分不均带成分不均 一；一； 一些低拷贝数一些低拷贝数 mRNA不能有效呈现等不能有效呈现等 15 （二）基因表达序列分析技术（二）基因表达序列分析技术 (serialanalysisofgeneexpression ,SAGE n 来自来自 cDNA3特定位置的一段特定位置的一段 9-11bp长的序列能够长的序列能够 区别基因组中区别基因组中 95%的基因。这段基因特异的序列被的基因。这段基因特异的序列被 称为标签（称为标签（ SAGE tag) n 目的：获得基因在特定组织中的表达及基因表达目的：获得基因在特定组织中的表达及基因表达 丰度丰度 n 前提：前提： Genbank必须有某一物种的必须有某一物种的 DNA序列信息。序列信息。 16 n （三）微阵列分析（三）微阵列分析 DNA微阵列微阵列 (microarray assay) 或或 DNA芯片芯片 (DNA chip) 发红色荧光发红色荧光 Cy3 发绿色荧光发绿色荧光 Cy5 17 cDNA微阵列技术微阵列技术 n 优点优点 灵敏度高灵敏度高 mRNA丰度低至丰度低至 10万分之一仍能被检万分之一仍能被检 测出可同时采用几种不同颜色的荧光染料标记探测出可同时采用几种不同颜色的荧光染料标记探 针，在同一张阵列膜进行一次杂交实验就可分析针，在同一张阵列膜进行一次杂交实验就可分析 不同样品间基因表达的差异不同样品间基因表达的差异 n 缺点缺点 成本较高成本较高 需要特殊的信号检测分析系统，玻需要特殊的信号检测分析系统，玻 片上的微阵列不能重复使用片上的微阵列不能重复使用 18 （四）（四） RNA干涉（干涉（ RNA interference, RNAi)技术技术 RNA干涉是近年来发展的一种基因功能研究的方法，进干涉是近年来发展的一种基因功能研究的方法，进 而从反向角度来阐明基因的功能。而从反向角度来阐明基因的功能。 RNAi是指将外源性双链是指将外源性双链 RNA导入细胞后，可产生导入细胞后，可产生 21- 23nt长度的小分子干涉长度的小分子干涉 RNA，引起与其同源的特异基因，引起与其同源的特异基因 mRNA降解的现象，属于转录后的基因沉默。降解的现象，属于转录后的基因沉默。 （五）单核苷酸多态性检测（五）单核苷酸多态性检测 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms, SNPs)指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的 DNA 序列多态性，在人群中发生频率大于序列多态性，在人群中发生频率大于 1%。 19 n 目前最常用技术路线是利用目前最常用技术路线是利用 双向凝胶电泳双向凝胶电泳 分离蛋白、综合质谱和生物信息学分析分离蛋白、综合质谱和生物信息学分析 技技 术术 n 进行鉴定进行鉴定 双向凝胶电泳双向凝胶电泳 和和 质谱技术质谱技术 是目前是目前 蛋白质组学研究的核心技术蛋白质组学研究的核心技术 二、蛋白质组学技术平台 20 n （一）磁共振（一）磁共振 n （二）色谱（二）色谱 -质谱联用技术质谱联用技术 三、代谢组学技术平台 21 n 简而言之，是在生命科学的研究中，以计算机为简而言之，是在生命科学的研究中，以计算机为 工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。 n 是获取、处理、储存、分析和解释生物信息的一是获取、处理、储存、分析和解释生物信息的一 门学科，它综合运用数学、计算机科学的各种工门学科，它综合运用数学、计算机科学的各种工 具，以核酸、蛋白质等生物大分子数据库作为主具，以核酸、蛋白质等生物大分子数据库作为主 要研究对象，对巨量生物学原始数据进行存储、要研究对象，对巨量生物学原始数据进行存储、 管理、注释、加工，使之成为具有明确生物学意管理、注释、加工，使之成为具有明确生物学意 义的生物信息。义的生物信息。 四、生物信息学 (bioinformatics) 22 生物信息学的组成生物信息学的组成 n （一）生物学数据库（一）生物学数据库 DNA序列数据库、蛋白质一级数据库、蛋白质二序列数据库、蛋白质一级数据库、蛋白质二 级数据库等级数据库等 n （二）生物信息学分析方法（二）生物信息学分析方法 序列比对预测、结构比对预测、功能比对预测序列比对预测、结构比对预测、功能比对预测 n （三）应用软件（三）应用软件 GCG、 Staden 23 毒作用机制研究 化学物毒性预测 比较毒理学研究 混合物联合毒作用研究 危险度评定 表型锚定 信息整合 第三节 毒理基因组学研究的内容及其应用 24 n 传统毒理学使用大量的动物模型进行毒传统毒理学使用大量的动物模型进行毒 性测试性测试 ,存在使用动物多、周期长、工作存在使用动物多、周期长、工作 量大的缺点。量大的缺点。 n 检测指标：基因表达检测指标：基因表达 n 更敏感、更特异更敏感、更特异 一、毒作用机制研究 25 n 分子标志物或分子标志物或 “基因指纹基因指纹 ( fingerprints)”， 通常依赖对基因转录表达的分析。通常依赖对基因转录表达的分析。 n 单基因的检测方法，分析能力有限单基因的检测方法，分析能力有限 n DNA微阵列技术微阵列技术 的发展的发展 ,实现了对群体基因的实现了对群体基因的 平行检测平行检测 ,因此因此 ,直接对基因表达谱进行分析直接对基因表达谱进行分析 可能是未来毒理学研究的一个重要方向。可能是未来毒理学研究的一个重要方向。 26 n 在新化合物开发过程中，将其基因表达谱在新化合物开发过程中，将其基因表达谱 与已知化合物的与已知化合物的 “ 基因指纹基因指纹 ” 相比较，就相比较，就 可以从中推测新化合物是否具有某种相似可以从中推测新化合物是否具有某种相似 的毒性效应，从而进一步设计更全面和更的毒性效应，从而进一步设计更全面和更 细致彻底的毒性检测。细致彻底的毒性检测。 二、化学物毒性预测 27 n (1)选定已知毒性物质作为标准参照物选定已知毒性物质作为标准参照物 ,如常见的内分如常见的内分 泌干扰物、重金属泌干扰物、重金属 (如铅、汞、砷如铅、汞、砷 )、致癌物多环芳香、致癌物多环芳香 烃烃 如苯并如苯并 ( )芘芘 等等 ; n (2)选定参照物已知或者可能作用的靶基因作为阵列目选定参照物已知或者可能作用的靶基因作为阵列目 标基因标基因 ,如基因、基因、如基因、基因、 53基因、基因、 基因、修复酶基因、细胞色素基因、修复酶基因、细胞色素 450基因家族基因家族 等。等。 n (3)在特定组织或细胞中在特定组织或细胞中 ,用暴露于参照物质时靶基因用暴露于参照物质时靶基因 的表达谱与受试物表达谱进行比较的表达谱与受试物表达谱进行比较 ,预测其毒作用类型预测其毒作用类型 ； n (4)应用统计学分类方法如聚类分析、自组图分析发现应用统计学分类方法如聚类分析、自组图分析发现 两类毒物的基因表达模式的差异。两类毒物的基因表达模式的差异。 根据研究目的可分别设计识别化学物的毒性 、毒作用途径或靶器官的阵列 ,基本程序如 下 : 28 n 问题：动物实验结果外推到人类问题：动物实验结果外推到人类 -动物模型动物模型 n 解决的关键：桥梁生物标志物解决的关键：桥梁生物标志物 (bridging biomarkers)，能够在不同物种间进行毒性比较的，能够在不同物种间进行毒性比较的 生物标志物生物标志物 n 技术：高通量的技术：高通量的 DNA微阵列技术微阵列技术 n 意义：桥梁生物标志物用于比较不同种属间毒性意义：桥梁生物标志物用于比较不同种属间毒性 反应的不同，特别是显示某一损伤即将出现的生反应的不同，特别是显示某一损伤即将出现的生 物标志物标志 ,从而可在安全允许的范围内进行人体试验从而可在安全允许的范围内进行人体试验 。 三、比较毒理学研究 29 n 安全性评价只研究一段时间内一个化合安全性评价只研究一段时间内一个化合 物的毒性物的毒性 n 从一系列单独的化合物的试验结果外推从一系列单独的化合物的试验结果外推 至这些物质混合后的效应是不科学的至这些物质混合后的效应是不科学的 n 高通量的基因组学和蛋白质组学手段检高通量的基因组学和蛋白质组学手段检 测基因、蛋白质的变化为研究混合物暴测基因、蛋白质的变化为研究混合物暴 露后评价化合物之间的协同性或拮抗。露后评价化合物之间的协同性或拮抗。 四、混合物联合毒作用研究 30 n 传统毒性测试方法的危险性评价正朝着对各种传统毒性测试方法的危险性评价正朝着对各种 科学数据进行整合的方向发展科学数据进行整合的方向发展 ,在此在此 ,生物标志生物标志 物就显得尤为重要。物就显得尤为重要。 n 目前的标志物多为毒物代谢物、目前的标志物多为毒物代谢物、 DNA加合物、组加合物、组 织病理以及生化改变织病理以及生化改变 ,数量有限且不一定具备足数量有限且不一定具备足 够的敏感性和特异性。够的敏感性和特异性。 n 基因组技术为毒理学研究提供了大量可供筛选基因组技术为毒理学研究提供了大量可供筛选 的生物信息分子的生物信息分子 ,结合生物信息学分析技术结合生物信息学分析技术 ,有有 望确定敏感、特异的生物标志物。望确定敏感、特异的生物标志物。 n 个体易感性分析融入危险性评价个体易感性分析融入危险性评价 五、危险度评定 31 n 是将特定的基因图谱改变于特定剂量或是将特定的基因图谱改变于特定剂量或 时间条件下的毒性损害相联系的过程。时间条件下的毒性损害相联系的过程。 n 相关表达谱的表型锚定是毒性评价的基相关表达谱的表型锚定是毒性评价的基 础，目前已进行基因表达谱与疾病病理础，目前已进行基因表达谱与疾病病理 相关性研究的仅有坏死、凋亡、纤维化相关性研究的仅有坏死、凋亡、纤维化 、炎症等表型，尚有大量工作待进行。、炎症等表型，尚有大量工作待进行。 六、表型锚定 32 n 一是一是 对经某种暴露后一个个体（动物或人）有对经某种暴露后一个个体（动物或人）有 不同技术平台（基因组学、转录组学、蛋白质不同技术平台（基因组学、转录组学、蛋白质 组学、代谢组学）获得的测定结果进行比较和组学、代谢组学）获得的测定结果进行比较和 分析，找出其联系和变化规律。分析，找出其联系和变化规律。 n 二是二是 对不同个体甚至不同