遗传学第九章 基因工程和基因组学ppt课件

第九章 基因工程 和基因组学 v 1基因工程 (Gene engineering) v 一、基因工程概述v 1、基因工程的概念v 20世纪 70年代随着 DNA重组技术的发展在遗传学上产生了一门新的分支遗传工程（ Genetics engineering ）v 遗传工程 :又称遗传操作（ Genetic manipulation） ,是以分子遗传学为v 基础，以现代物理、化学等为手段，按照人们设 计的 生物v 蓝图 在细胞、染色体和基因等不同水平上， 对生物的遗传v 性状 进行定向改造，创造新的生物类型。v 广义的遗传工程：包括细胞工程、染色体工程、v 细胞器工程、基因工 程。v 狭义的遗传工程：即基因工程Date 1v v 2.基因工程的发展 ：基因工程的产生和发展在遗传学的发展史上是一次大革命，它打破了种、属的界线，可以 在生物大系统内交流基因 。其发展情况如下：v 1971年，史密斯（ Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种 限制性酶 v 酶切病毒 DNA分子，标志着 DNA重组时代的开始。1972年 伯格（ Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体v DNA，将两种 DNA分子用连接酶连接起来 得到新的 DNA分子。1973年，科恩（ Cohen S.）等进一步将酶切 DNA分子与质 DNA连接起v 来，并将重组质粒转入 E.cloi细胞中。1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，v 用基因工程在细菌中生产人的v 胰岛素投放市场。v 1985年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1996年，克隆羊诞生。 v Date 2v 美国 批准上市 的 基因工程产品 有：人类胰岛素、人类生长因子、白介酸、干扰素、牛型生长激素、疫苗等，并不断有新的品种进入临床应用。v 在农业上也有很多应用，如 1985年开始 转基因 作物品种培育，在高梁、水稻、烟草、玉米、棉花等作物上都获得成功。Date 3v 全世界转基因植物种植面积为 ：v 1996年全世界转基因植物种植面积为 170万公顷，v 1997年为 1100万公顷，v 1998年 2780万公顷，v 1999年 3990万公顷，v 2000年 4420万公顷，v 2001年 5260万公顷，v 2002年 5000万公顷。Date 4v 2001年种植面积 100万公顷的转基因作物 ：v 大豆（ 3330万 hm2，占全世界转基因作物的 63%，均为抗除草剂大豆） 玉米（ 980万 hm2 ， 占 19% ） v 棉花（ 680万 hm2 ， 占 13% ） v 油菜（ 270万 hm2 ， 占 5% ） 其它还有水稻、小麦、花生、日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等 50多种转基因作物已培育成功。主要分布在美国（ 3570万 hm2 ）、阿根廷（ 1180万 hm2 ）、加拿大（ 320万 hm2 ）和中国（ 150万 hm2 ）等国。Date 5v 下图为 2001年全世界转基因作物占相应作物 种植总面积的比较vv 2001年 我国的转基因农作物和林木 已达 22种 ， 其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。 Date 6v 3内容： 从细胞和组织中分离和纯化 DNA；v 利用能识别特异性 DNA 序列的限制性内切酶剪切 DNA分子，制 备含有v 目的基因的 DNA片段，或采用酶学和化学合成的方法人工合成基因； 将 DNA片段或人工合成的基因与能够自我复制并具有选择标记的载体在体外连接，形成重组 DNA分子； 将重组的 DNA分子引入受体（宿主）细胞中，使重组 DNA分子在受体细胞内复制，产生多个拷贝，即克隆（ clone）； 重组 DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞中，使子代群体细胞均具有重组的 DNA分子的拷贝； 从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定含有目标基因的重组 DNA分的，受体细胞的克隆；v . 能从选出的宿主细胞中回收、纯化、和分析克隆的重组的 DNA分子；v .克隆的基因能够正常表达。Date 7v基因工程的主要步骤可概括为：v 1.分离或合成目的基因；v 2.将带有目标基因的 DNA片段与载体 DNAv 体外重组；v 3.将重组的 DNA分子引入到；v 4.重组体克隆的筛选和鉴定。v Date 8v 二、限制性内切核酸酶：v 限制性内切核酸酶 ，是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到，这些酶 能识别特定的核苷酸序列 ， 在细胞中主要是用来水解外来 DNA分子而保护自身的，所以称之为 限制性内切酶 。 是基因工程的常用工具v 以 交错方式 切断 DNA双链，v 产生二个相同 单链粘性末端 。v 在适宜的条件下，两个 DNAv 分子的黏性末端连接成双链v 的重组 DNA分子。v Date 9v 限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示； . EcoR I 来自大肠杆菌（ Escherichia coli）； . Hind 来自嗜血杆菌（ Haemophilus influenzae）。Date 10v 限制性内切酶的类别：根据限制性内切酶的作用特点， 可分为两类 ：第 类酶、第 类酶v 第 类酶 ：v 如 EcoB(大肠杆菌 B株 )、 EcoK(大肠杆菌 K株 )分子量较大 (约 300， 000)，作 v 用时需 ATP、 Mg+等辅助因子。v 由于这类酶的切割部位无特异性，是随机的，每隔一段 DNA 序列随机切割双链 DNA分子，切割点不固定，所以在基因工程中很少应用。 第 类酶 （）：如 EcoR I(大肠杆菌 )、 Hind (嗜血杆菌 )，分子量较小 (约 20， 000-100， 000)v 作用时需要有 Mg+存在。v 这类酶的切割部位有 特异性 ，可 准确切割 DNA双链的 特异序列 ，因此在基因工程中广泛应用。v Date 11v这类酶的切割点是对称序列。v 如 回文对称序列 （ palindrome，又称反向重复序列，即从两个方向阅读，其序列相同的序列）。识别特定的碱基序列，交错切割产生 二个粘性末端 （ sticky ends），如 BamH I、 Pst I ：vv 两个 DNA分子的 黏性末端 连接成双链的 重组 DNA分子 。v Date 12v Sma I 是另一种类型，这种酶切割 DNA双链 后产生二个平齐末端（ blunt ends），如v 两个 平齐末端 也可以在 DNA连接酶的作用下 连接成 重组 DNA分子。v P217 表 9-1 列出了部分常用的限制性内切酶Date 13v 三、载体（ vector）：v 载体 是 将 “目的 ”基因即重组 DNA分子导入 受体细胞 的 运载工具 。v DNA片段 +适合的载体 DNA 重组 DNA 在载体 DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制、扩增、克隆出许多拷贝。DNA载体： 质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。v 载体的条件 ： .具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的 外源 DNA一起复制 。 .具多克隆位点 (multiple cloningsite， MCS 或 polylinker region)，即有多种限制酶的切点；且切点不存在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记性状的表现。 .至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基因。 .易从宿主细胞中回收克隆。Date 14根据载体的作用 ，可把 载体分为三类 ：克隆载体、表达载体 和 穿梭载体 。v克隆载体： 是指主要用于在受体细胞中扩增目的基因的一类载体，一般具有较低的分子量，其复制不是处于寄主的严密控制之下，较高的拷贝数和松弛型复制子，主要有 细菌质粒或与其他质粒、噬菌体及其真核生物病毒的 DNA重组构建。Date 15v 表达载体： 使 目的基因在受体细胞中表达的载体。作为表达载体可将重组 DNA导入适合的受体细胞，使其所载荷的基因能够复制、转录和翻译。这类载体具有 强启动子 等调控序列；有使 RNA聚合酶 只转录克隆基因而不能转录无关序列 的 强终止子 ；其次，启动子还应是受控制的即 只在诱导 时才进行转录，以保证转录效率和防止给细胞造成不利影响；此外所产生的 mRNA必须具有翻译的 起始信号 AUG 和 SD序列 ，在启动子与目的基因或 SD序列与目的基因的起始密码子 AUG 之间还要 有正常间隔，以不造成移码，所转录的 mRNA可翻译成目的蛋白，而且这种蛋白在寄主细胞中可保持稳定且便于提取。v 迄今 ，已设计和构建了一系列以原核启动子代替真核启动子的质粒表达载体，如大肠杆菌乳糖操纵子、色氨酸启动子德 Trp启动子以及 噬菌体PI启动子等分别构建的启动子。v Date 16v 穿梭载体： 又称双功能载体，具有 克隆载体 和 表达载体 两种作用，能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭。即能在在原核生物细胞中扩增，又能在真核生物细胞中复制和表达。主要用于在原核细胞和在真核细胞之间进行基因转移。通常是将载体和待克隆的真核生物 DNA 片段现在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。v 这类载体必须 即具有 细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物体的复制原点，如 SV40复制原点或酵母的自主复制系列v （ autonomously reolicoting sequence ,ARS),此外这类载体还应 具有可资利用的酶切位点和合适的筛选指标，这样的载体即可往来穿梭于原核细胞和在真核细胞之间进行基因转移。 穿梭载体 不仅可把目的基因引入真核细胞，而且还可以从真核细胞染色体上回收基因或 DNA片段。v Date 17v 下面是一些常用的载体：v 、细菌质粒 ： v 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链 DNA分子，是。质粒具有重组表型检测标记，可检测是否携带外源 DNA片段。v 可用于克隆分子量小于 10kb(1kb=1000bp)的外源 DNA片段v 下面左图为 pUC18质粒，右图为 pUC19质粒。 Date 18v如 pUC18质粒具有以下特点： . 分子量小，可接受较大外源片段； . 拷贝数多， 500个细胞； . 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； . 具有用于检测重组质粒的选择标记v （ 如 互补的显色表型）。v Date 19v 、 噬菌体（温和型）： v 基因组全长为 49kb。噬菌体 DNA中间约 2/3的序列为中间基因簇，两端为 DNA左、右臂。中间基因簇可被外源 DNA替代而不影响侵染细菌能力。能接受 15-23kb外源 DNA片段， 作为 cDNA或核 DNA克隆载体。优点：* 不易引起生物危害，有助于 “目的 ”基因进入细胞并增殖；* 携带大片段外源 DNA分子，占总量 25%时仍不失活。 v v 1. 噬菌体v 2. 噬菌体 DNAv 3. 噬菌体 DNA 中间基 v 因簇v 4. 噬菌体 DNA两个臂v 5. 外源 DNA片段 将连接物v 体外包装感染细菌，v 制备基因库v 6. 携带有重组 DNA分子 v 的噬菌体Date 20v 、柯斯质粒 (cosmid)： （克隆载体）噬菌体 DNA 部分细菌质粒 DNA序列 柯斯质粒。有噬菌体 cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。这种质粒分子量较小，但 可接受长达 50kb的外源 DNA片段 克隆真核生物基因。 一个长片段 DNA可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。Date 21v 、穿梭载体（ shuttle vectors）：指能在两种不同生物中复制的载体。如能在原核生物 (如 E.coli)、真核细胞 (如酵母 )中复制的载体。穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列 (Auto-nomously replicating sequence,ARS)以及两者的选择标记。穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母中用于基因表达分析。 酵母菌的 YEp (yeast episomaplasmid)等系列载体均是穿梭载体。Date 22v 、细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome， BAC)：BAC载体一般 可携带 大于 50kb的外源 DNA片段 。 F因子改造成BAC载体 ， 甚至可用于 克隆 100kb以上的 DNA片段 。 特点：带有外源 DNA的 BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体分子量很小 (7.4kb)；选择标记：氯霉素抗性基因；多克隆位点。Date 23v 、酵母人工染色体 (yeast artificial v chromosome， YAC)：YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点； 可接受 100 1000kb的外源DNA片段。YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；并促进了人类人工染色体 (human artificial chromosome， HAC)的研究。1996年完成了酵母菌全基因组序列的测定 。Date 24v pYAC4特点 ：1.两个 可在酵母菌中利用的 选择基因 ， URA3和 TRP1(色氨酸合成基因 )；2.酵母菌着丝粒序列 (CEN4)；3.一个自主复制序列 (ARS1)；4.两个嗜热四膜虫末端重复序列 (TEL) 保持重组 YAC为线状结构；5.在两个末端序列中间，有一段填充序列 (His3),使 pYAC4在细菌细胞中能稳定扩增；6.Amp抗性及细菌质粒复制原点；7.一个 EcoR I 克隆位点，位于酵母菌 Sup4tRNA基因内。下图为酵母菌人工染色体 pYAC4：在克隆外源 DNA时，用 BamHI和 v EcoRI双酶切，得到二个人工染色体臂，与 EcoRI酶切的外源 DNA片段连接， 构成重组的酵母 人工染色体，用于转化酵母菌 v Date 25、 Ti质粒及其衍生载体：适合于植物的载体系统 将重组 DNA运载到植物细胞中 目的基因表达。Ti质粒 (细菌质粒 )：自然存在于 土壤农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴菌 )细胞 可诱导植物产生瘤细胞 (tumor-inducing, Ti) 冠瘿瘤 (grown galltumors)。Ti质粒有一部分转移 DNA(transfer DNA， T-DNA) 当农杆菌 植物时，T-DNA 植物染色体上，诱导冠瘿瘤，并能合成冠瘿 (opine)，作为农杆菌碳源和氮源。Date 26v Ti质粒特点：1. 具有五个主要功能区域： . T-DNA： LB与 RB间 T-DNA序列整合到植物基因组； . 质粒转移区 (PT)； . 冠瘿碱 (opine)代谢区； . 复制原点； . 毒性区。v 2. T-DNA中