第三章提取和分离

第三章DNA的提取与纯化的提取与纯化基因工程需要三种不同的 DNA:总 DNA质粒 DNA噬菌体 DNA学习内容：l 制备细胞总 DNA 培养、搜集细菌细胞 制备细胞提取物 DNA纯化、浓缩 从其他生物中提取总 DNAl 质粒 DNA提取 根据分子大小分离 根据结构分离 质粒扩增l 提取噬菌体 DNA 噬菌体的培养 制备非溶源性噬菌体 收集噬菌体 从 噬菌体中纯化 DNA 纯化 M13 DNA Figure3.1 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteriaBasic Steps1.制备总 DNA基本步骤：1) 收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉 DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩1.1培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：lM9培养基：Na2HPO4(6.0) KH2PO4(3.0) NaCl(0.5) NH4Cl(1.0) MgSO4(0.5) Glucose(2.0) CaCl2(0.015)lLB培养基：Yeast extract(5) NaCl(10)1.1培养、收集细菌细胞37C， 150-250rpm达到最大浓度 2-3109cell/ml, 600nm下的 OD值， 1OD相当于0.8109cell/ml Figure3.2 Estimation of bacterial cell number by measurement of optical densityFigure3.3 Harvesting bacteria by centrifugation1.2 制备细胞提取物l利用溶菌酶、 EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。EDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解 DNA酶的活性。一般溶菌酶或 EDTA足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入 SDS。Figure3.4 Preparation of a cell extract.Preparation of a cell extractFigure3.5 Removal of protein contaminants by phenol extraction. Purification of DNA from a cell extract1.制备细胞总 DNA1.4 DNA的浓缩与浓度测定l最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有 Na离子）。 DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。l260nm下测定吸光度， 1OD相当于 50g双链 DNA/ml。 A260/A280=1.8， 2说明有 RNAFigure3.6 Collecting DNA by ethanol precipitation . Concentration of DNA samples Figure3.7 The CTAB method for purification of plant DNA Plant DNA(CTAB法法)十六 烷基三甲基溴化铵Figure3.8 The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.阴离子交换层析法阴离子交换层析法2 质粒 DNA提取l质粒 DNA的大小（ 8%）。lDNA的构造 Alkaline denaturation Ethidium bromide（溴化二氨乙苯啡啶） -caesium chloride（氯化铯） density gradient centrifugation2质粒 DNA提取2.1 根据分子大小提取质粒 DNAlsphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。 l问题：裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA质粒分子非常大时 ，将与染色体 DNA共沉淀Figure3.9 Preparation of a cleared lysate.Sphaeroplast残壁 细胞2质粒 DNA提取2.2 根据分子构造提取l碱裂解法基本原理：在非常窄的 pH范围内，非螺旋化的 DNA会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调 pH值至12.012.5,破坏氢键，使 DNA变性。加入酸，变性的细菌 DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用SDS（十二烷基磺酸钠）（ Sodium dodecyl sulfate， SDS），裂解， KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和 RNA。Figure3.10 Two conformation of circular double-stranded DNA.Two conformation of circular double-stranded DNAFigure3.11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method.Alkaline denaturation2质粒 DNA提取2.2 EB CsCl密度梯度离心法l在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是 DNA，下部是 RNA。Figure3.12CsCl density gradient centrifugation.CsCl density gradient centrifugation2.2 EB CsCl密度梯度离心法lEB插入相邻的碱基之间，降低了 DNA的浮力密度，但超螺旋的 DNA结合 EB浮力密度降低较小，仅有 0.085g/cm3。lCsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达 100%。Figure3.13Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between adjacent base parirs.EBEB如何与 DNA结合 ?Figure3.14Purification of plasmiod DNA by EtBr-CsCl density gradient centrifugation如何分离质粒DNA？2质粒 DNA提取2.3 质粒扩增一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如 氯霉素 ，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。Figure3.15 Plasmid amplification Plasmid amplificationInhibitor of protein synthesis: Chloramphenical, 12h, 3 噬菌体 DNA的制备当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白