植物组织培养的基本方法

植物组织培养的基本方法目的要求 1一般掌握灭菌和消毒的区别 2掌握灭菌的方法和具体操作过程 3掌握无菌接种的步骤 4掌握外植体的选择、培养方法和步骤 5一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法 6掌握试管苗驯化的基本程序 7一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算方法 灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把 所有生命的物质全部杀死。 消毒，它指杀死、消除或充分抑制 部分微生物 ，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。 而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做 无菌操作。 常用的灭菌方法可分为 物理的和化学的 两类。 物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。 这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的 24小时内 完成灭菌工序 按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。 容器的体 积 （ ml） 在 121 灭 菌所需最少 时间 （min） 2. 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入 95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰上 灼烧灭菌 。冷却后，立即使用。操作中可采用 250或 500ml的广口瓶，放入 95%的酒精，以便插入工具。 3.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 干热灭菌是利用烘箱加热到 160 180 的温度来杀死微生物。 通常采用 170 持续 90分钟 来灭菌 。 4. 不耐热的物质采用过滤灭菌 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用 过滤灭菌方法 -防细菌滤膜 。 5.空间采用紫外线和熏蒸灭菌 （ 1）紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用 辐射因子 灭菌。 细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。 紫外线的波长为 200300nm，其中以 260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和 物体表面 的灭菌，且要求距照射物以不超过 1.2米为宜。 （ 2）熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法 ，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是 甲醛 。 6.一些物体表面用药剂喷雾灭菌 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用 70的酒精 反复涂擦灭菌，的来苏儿溶液以及 0.25的新洁尔灭也可以。 7. 植物材料表面用消毒剂灭菌 外植体的选择 : 外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样； 取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集； 器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力； 外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。 外植体的灭菌方法 : 植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做 接种 。接种的植物材料叫做外植体。 首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。 第三步是用灭菌剂处理。 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次 3分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗 3 10次左右。 常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。灭 菌 剂 使用 浓 度 持 续时间 (min) 去除的难易 效果次 氯 酸 钙 90-100g/l 5 30 易 很好次 氯 酸 钠 5-20g/l 5 30 易 很好漂白粉 饱 和溶液 5 30 易 很好氯 化汞 0.1-10g/l 2-10 较难 最好乙醇 700-750ml/l 0.2-2 易 好过 氧化 氢 100-120ml/l 5-15 最易 好溴水 10-20ml/l 2-10 易 很好抗菌素 4 50mg/L 30 60 中 较 好接 种接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。 接种前后的程序： A：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌 15-20分钟，然后通风 20分 钟； B：手要洗净，用 75%酒精擦手，在操作过程中要经常用酒精擦手； C：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用 75%酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗最后沥去水分，取出放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。 D：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。 E：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 培养 培养：指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 （一）培养方法 1固体培养法 即用 琼脂 固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法 。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。 2液体培养法 即用 不加固化剂 的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用 往复式摇床或旋转式摇床 进行培养，其速度一般为 50 100转分，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 静止培养：滤纸桥培养 振荡培养：磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架 (二）培养步骤： 1初代培养：即接种某种外植体后，最初的几代培养。 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。 初代培养时，常用诱导或分化培养基 ，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。 （ 1）顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的 茎切段 ，其它如种子萌发后取 枝条 也可以。 （ 2）不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽 ,通常首先 要经脱分化过程 ,形成愈伤组织的细胞。 多数情况下它先形成芽，后形成根。 另一种方式是从器官中直接产生不定芽，如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。许多常规方法不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基，如非洲菊、草莓等。 （ 3）体细胞胚状体的发生与发育 2继代培养：在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等 ,数量都还不多，它们需要进一步 增殖 ，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。 继代培养是继初代培养之后的连续数代的 扩繁 培养过程。旨在繁出相当数量的无根苗，最后能达到边繁边生根的目的。继代培养的后代是按 几何级数 增加的过程。 在快速繁殖中初代培养只是一个 必经 的过程，而继代培养则是 经常性不停 的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。 从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。 3生根培养： 生根培养是使无根苗生根的过程。最后要使生出的不定根浓密而粗壮。生根可采用 1/2或者 1 4 培养基 ，全部去掉或用低浓度的细胞分裂素，并加入适量的 生长素 (NAA、 IAA等 )。 当新梢高达 3cm以上时 切除基部的愈伤组织 。用下列方法诱导生根（ 1）将新梢基部浸入 50或 100ppm IBA溶液中处理 48小时。（ 2）在含有生长素的培养基中培养 4 6天。（ 3）直接移入含有生长素的生根培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生根。但前二种方法对新生根的生长发育更有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。因为当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。 试管内生根壮苗的阶段，目的是为了成功地移植到试管外的环境中，使试管苗适应外界的环境因子。不同植物的适宜驯化 温度 不同。如菊花，以 18 20 为宜。温度过高牵涉到蒸腾加强。以及菌类易滋生等问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活春季低温时苗床可加设电热线使基质温度略高于气温 20 3 ，这利于生根和促进根系发达，有利于提前成活。 光强 应比以前培养有所提高。以强度较高的漫射光为好，约4000Lx左右为宜，以维持光合作用所需光强。但光线过强刺激蒸腾加强，使水分平衡的矛盾更尖锐。 培养物污染原因和预防措施1、污染：是指在组织培养过程中由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降，叶片缺绿，甚至死亡。2、原因：培养基及各种使用器具消毒不彻底，外植体灭菌时不彻底，操作时人为因素带入，工作区域污染等。3、控制：器具在高温灭菌后，在使用过程中需要不断地在酒精灯上进行 灼烧消毒 ；所使用的外植体在常规的消毒后，可能还带有一定量的菌，可以先在培养基上进行几天的 预培养 ，再转到分化培养基上，另外也可以通过在培养基中添加 抗生素 来抑菌。初代培养外植体的褐变 外植体褐变 是指在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体有变褐色而死亡的现象。 原因： 很多植物都含有较多的 酚类化合物 ，其在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在细胞受到伤害时，分隔效应被打破，酚类化合物外溢，与多酚氧化酶接触而氧化成 褐色 的 醌类物质 和水。醌类物质在酶的作用下，与外植体中的蛋白质聚合，从而使其它酶失活，组织代谢活动紊乱，生长停滞。 影响因素 1、植物种类和基因型： 木本植物、单宁或色素含量高的植物易发生褐变； 2、外植体的来源和生理状况 ：幼龄材料一般比成龄材料褐变轻（含酚类物质少）；同一植物冬春季取材褐变死亡率最低，其它季节不同程度增加； 3、外植体的大小： 小材料更易褐变，大材料切口越大，酚类氧化面越大，易褐变；消毒的化学试剂也会引起褐化； 4、培养基：浓度过高的无机盐 会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外， 细胞分裂素 的水平过高也会刺激某些花卉外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。 5、培养条件不当： 例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。 控制褐变的措施 1、外植体和培养材料进行 20-40天的 遮光处理或暗培养 ，可减轻部分种类的褐化程度； 2、在接种前用无菌水反复清洗外植体并对外植体进行冷藏处理， 洗尽切口处渗出的酚类物质 ，可起到减轻褐化作用； 3、控制温度和光照，在不影响正常生长和分化的前提下，尽量 降低温度，减少光照 ； 4、在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等 抗氧化剂 能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。在培养基中加入0.5-1%左右的 活性炭 ，用以吸附褐变产生的有害物质，减轻褐变影响； 5、 连续转移： 对容易褐变的材料可间隔 12 24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理 7 10天后，褐变现象便会得到控制或大为减