时间分辨荧光技术trfia技术培训资料

广州医学院免疫检验教研室冯健明 讲师 时间分辨荧光技术时间分辨荧光技术一、回顾标记免疫学发展一、回顾标记免疫学发展标记免疫技术的检测水平 放射免疫 （精度： 10-12mol/L ） 酶联免疫 （精度： 10-9 mol/L ） 化学发光 （精度： 10-15mol/L ） 电化学发光 （精度： 10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度： 10-18mol/L ）放射性免疫分析法（ RIA）应应 用用 放免自 60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。 夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。问问 题题 放射性（ 125 I）， 对环境的污染及对身体的危害 125 I 的半衰期短而导致其试剂有效期短 被标记物的稳定性差 操作繁琐，费时 无法保存备用酶免疫分析法（ ELISA）应应 用用 酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害 试剂有效期较长 曾经一度被认为是取代放免的检测手段问问 题题 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好化学发光免疫分析法 （chemiluminescent immunoassay）应应 用用 单个样本检测速度快，适合做急诊 灵敏度较高 自动化程度高 分类： 以丫啶酯直接标记 以 HRP标记，鲁米诺为发光底物 Amerlite系统 以 AP(碱性磷酸酶 )为标记物， AMPPD为发光底物问问 题题 样品不能重复检测 本底较高 仪器故障率较高 试剂稳定性较差 检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足 非开放性试剂；试剂价格高电化学发光免疫分析法（ ECL）应应 用用 80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法 基本原理：根据三联吡啶钌 Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应 本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽 以罗氏为代表缺缺 点点 非开放性试剂系统、不能做科研 试剂价格过高二、时间分辨荧光技术 （ Time-Resolved Fluorescence）时间分辨荧光发展史 1979年， 提出 “ 时间分辨荧光免疫分析 ” 理论， 1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。 90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段时间分辨免疫荧光技术的定义 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质 当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离 增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的TRF分析原理图（ 1）加样本加样本振荡、洗板振荡、洗板加入加入 Eu标标VVEu标记物轻链螯合剂Eu重链振荡、洗板振荡、洗板V加入解离增强液加入解离增强液仪器检测标记物为稀土金属 -镧系元素铕 (Eu)、 钐（ Sm)、镝 (Dy)、锝 (Tb)镧系元素荧光特点：1、荧光寿命极长镧系元素螯合物（ 60900 us) 普通荧光免疫中荧光团： 1100us样本中蛋白质荧光： 110us， 易猝灭利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为 0TRF分析原理图（ 2）标记物为稀土金属 -镧系元素2、 Stokes位移大 （大约 290nm）铕：激发光 340nm、 发射光 613nm荧光 素的 Stokes位移 为 280nm3、 荧光特异性强 （发射光谱带很窄： 615 5nm）4、 解离 -增强技术 可使其荧光性提高 100万倍巨大 Stokes位移发射光谱与激发光谱间存在的巨大 Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离TRFIA为临床检测带来的先进性技 术 特点 检验 先 进 性时间 分辨光 谱 分辨特异性 荧 光与非特异性荧 光分离发 射 荧 光与激 发 光分离零背景、高特异性高灵敏度解离 -增 强 荧 光性大大提高稳 定的 荧 光螯合物线 性范 围宽高灵敏度原子 标记 标记 位点多，可达 20个对标记 物 结 构及活性影响小无衰 变受 环 境影响小高 稳 定性，高精确度试剂 保 质 期至少一年标 准曲 线 保留 时间长同一批次可两点定 标多 标记 单 ，双，三，四 标记 同一 试剂 盒可同 时测多个 项 目灵敏度更高，检测范围更广以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂 DELFIA（ WALLC ） Immulite（ DPC化学发光） ACS-180(拜 尔） AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH 0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml FSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500U/L 51002000Cps.10 3DELFIA hFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长时间分辨荧光与化学发光方法学比较时间分辨荧光时间分辨荧光 化学发光化学发光 发光效率 95% 1% 重复检测 可无数次 不可重复 本底噪声 零本底 干扰大 灵敏级数 10-18 10-15 标记物 原子 大分子化合物 标记位点 可达 20个 /抗体 1个 /抗体 标准曲线 稳定达一年以上 稳定 2 到 4周 多标记 有，最多可达四标记 无 科研开发 有 无时间分辨荧光和电化学发光的比较时间分辨荧光时间分辨荧光 电化学发光电化学发光 标记物 四种原子 : Eu, Sm, Tb, Dy 一种原子 : 钌 多标记技术 有 无 做科研 能 (1000多种科研项目 ) 无 试剂种类 58种临床 ,24种科研 , 28种临床 , 无科研试剂共 82种