大专生物化学专题一胶原蛋白的提取

生物化学实用技术章宇宁 2012.3 胶原蛋白是一种极其重要的 结构蛋白 ，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中。 占哺乳动物体内蛋白质总量的 25%30%，相当于体重的 6% 至少有 19种不同的类型 一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质 通常由 3 条多肽链组成，每条链都有左手螺旋结构，三条链绕成右手超螺旋。螺旋区段之外的部分常发生各种交联。 每一条链都有若干个典型的氨基酸序列 (-Gly-X-Y-) n 。 X、 Y 均表示任意的氨基酸 ,X 通常是脯氨酸(Pro) , Y 通常指羟脯氨酸 (Hyp ) 胶原蛋白中缺少 Cys和 Try 制造食品 止血，促进伤口愈合 作为可吸收的支架材料、缝合材料 作为药物载体 局部整形 从胶原蛋白较为丰富的组织（例如皮肤和肌腱）中提取 传统来源：猪牛羊皮 新兴来源：鱼鳞等 问题一：如何从原料中提取蛋白？ 问题二：如何从蛋白中分离胶原蛋白？ 问题三：如何检验得到的蛋白是胶原蛋白？前处理粗分级（粗提）细分级（分离纯化）作业一：某一特定蛋白质分离提纯的一般程序是什么？ 破碎组织细胞，使蛋白更好地与外界条件接触 尽量保持蛋白的天然构象和生物活性 注意控制条件 必要时加入蛋白保护剂 可以先将某一细胞组分分离出来动物材料 ：除脂肪组织 - 电动捣碎机、匀浆器、超声波植物组织 ：去种皮 - 石英砂、玻璃粉细菌细胞 ：超声波震荡、砂研磨、高压、溶菌酶 称取新鲜猪皮 100g，用氯仿 /乙醇（ 2:1）溶液对其进行 脱脂 后 切除皮下脂肪 ，去毛并细切。将用蒸馏水洗涤后的组织小块 放入高速组织捣碎机中捣碎成糊状 （12000r/min），用含 4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（ pH 7.5）充分洗涤以去除脂质及血清等成分，低温离心（ 8000r/min， 30min， 4OC）。 第一步：将蛋白与材料分开，使其进入溶液中 酸溶 碱溶 盐溶 酶解 注意根据所要提取的蛋白质的性质选择合适的粗分级方法 提取胶原蛋白常使用的溶剂是中性盐溶液 (0.152mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。前者只适合提取组织中最新合成的胶原以及交联度可以忽略的胶原。 稀酸，例如 0.5mol/L醋酸，柠檬酸缓冲液， pH值在 23之间的盐酸溶液，要比中性盐溶剂更为有效，但仍只能溶解出组织中大约 2%的胶原。 利用 10%的 NaOH溶液共同处理组织 48h左右，可以溶解出大部分胶原。与不溶性胶原结合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，胶原纤维瓦解。最终所得胶原的大小和分子质量，取决于处理时间以及碱的浓度。 酶可以将胶原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水 第二步：用简便且处理量大的方法去除无机物等杂质，得到浓缩蛋白质溶液 盐析 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 超滤 如蛋白相互差异较大，也可初步分离目标蛋白 可逆沉淀盐析法 (中性盐沉淀法 )： 向蛋白质溶液中加入 大量 的中性盐 ,使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。常用中性盐有 (NH4)2SO4、 Na2SO4、 NaCl等。有机溶剂沉淀法：常用与水互溶的有机溶剂如 甲醇、乙醇、丙酮等，破坏水膜，使其沉淀。 蛋白质的等电点： 蛋白质所带 净电荷 为零时，所处溶液的 pH 值即为该蛋白质的等电点。 在等电点时蛋白质最不稳定，溶解度最小。利用具有一定大小孔径的 微孔滤膜 ，对生物大分子溶液进行过滤，使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐或浓缩的目的。 进一步分离纯化目标蛋白质 透析 超滤 凝胶过滤 /层析 /离子交换色谱 密度梯度离心 电泳 等电聚焦 在粗提胶原蛋白溶液中缓慢加入 6mol/L NaOH至 pH=7，冷冻离心去除沉淀，在上清液中加入 NaCl搅拌， 4保存过夜；离心取沉淀，用稀 HAc溶解，将溶液装入透析袋中，用 0.1mol/L 的 Hac透析 1天，再用蒸馏水 透析 1天。 电泳：带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象 不同的蛋白质颗粒的大小、形状、所带的电荷、等不同，在电场中的泳动速度各异，因而可聚集形成不同的条带，从而达到分离的目的。层析法： 离子交换层析法 凝胶过滤层析法 亲和层析法 吸附层析法 分配层析法离子交换层析法原理 :根据 离子交换剂 与蛋白质进行离子交换，再利用适当的缓冲液洗脱，即可达到分离具有不同电荷性质蛋白质的目的。原理：混合物流经装有凝胶颗粒（凝胶颗粒内部具有大量一定大小的微孔）的层析柱时，大分子不能进入凝胶孔内，移动较快，并最先被洗脱出来；小分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长，移动速度较慢，最后被洗脱出来。亲和蛋白配基原理： 利用某种蛋白质能与其相应的专一性配基进行特异的可逆结合的 能力（亲合力