医微第4次实验

医学微生物学 实验四南华大学病原学实验中心南华大学微生物学与免疫学教研室肠杆菌科概述肠杆菌科肠杆菌科 （ Enterobacteriaceae)指指 一大群生物学一大群生物学 性状相似性状相似 的革兰的革兰 阴阴 性性 杆杆菌，常寄居在人和动物的菌，常寄居在人和动物的 肠道内肠道内 ， 亦存亦存在于土壤、水和腐物中。在于土壤、水和腐物中。肠杆菌科细菌种类繁多，肠杆菌科细菌种类繁多， 有有 44个属个属 ，170多个种多个种 ,引起引起 人类人类 感染的菌种感染的菌种 不到不到 20个个 种种 。 致病菌致病菌 ：伤寒沙门菌、志贺菌伤寒沙门菌、志贺菌 、鼠疫耶尔森菌等；、鼠疫耶尔森菌等； 机会致病菌机会致病菌 ：大肠埃希菌大肠埃希菌 、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌等 ，在宿主免疫力降低或侵入肠外组织时可致病在宿主免疫力降低或侵入肠外组织时可致病 ； 由正常菌群转变而来的致病菌由正常菌群转变而来的致病菌 ：引起胃肠炎的引起胃肠炎的 某些血清型某些血清型 大肠埃希菌大肠埃希菌 ， 通过基通过基因转移获得毒位于质粒、噬菌体或毒力岛上的毒因转移获得毒位于质粒、噬菌体或毒力岛上的毒力因子基因后而成为致病菌力因子基因后而成为致病菌与医学相关的肠杆菌科细菌分三类：与医学相关的肠杆菌科细菌分三类：生物学共性生物学共性1.形态结构形态结构 中等大小中等大小 G 杆菌杆菌 （ 不能鉴别不能鉴别 ）多有菌毛多有菌毛 /周鞭毛，周鞭毛， 少数少数 有荚膜，有荚膜， 无无 芽胞芽胞2.培养培养 营养要求不高营养要求不高 3.生化生化 反应反应 （重要（重要 鉴别依据鉴别依据 ）乳糖乳糖 发酵试验发酵试验 （初布鉴定）（初布鉴定） :致病致病 株株 (志贺菌志贺菌 /沙门菌等沙门菌等 ) -大多大多 非致病非致病 株株 肠杆菌科细菌革兰染色4.抗原结构抗原结构 （重要（重要 鉴别鉴别 依据）依据） ：主要有菌体：主要有菌体 O抗原抗原和鞭毛和鞭毛 H抗原和荚膜抗原。其他尚有菌毛抗原。抗原和荚膜抗原。其他尚有菌毛抗原。 O抗原抗原 H抗原抗原化学本质化学本质 LPS 蛋白质蛋白质耐热性耐热性 耐热耐热 不耐热（不耐热（ 6030min 破坏破坏 )变异变异 S-R H-O获得获得 加热加热 甲醛甲醛诱生的相应诱生的相应 Ab IgM为主为主 IgG为主为主荚膜抗原荚膜抗原 （型特异性）（型特异性）大肠杆菌：大肠杆菌： K-Ag伤寒杆菌：伤寒杆菌： Vi-Ag5.抵抗力抵抗力 较弱，较弱， 6030min 即死；即死；胆盐胆盐 /煌绿煌绿 抑制抑制 非非 致病性肠道杆菌致病性肠道杆菌6.易易 变异变异 :通过基因突变或基因转移通过基因突变或基因转移 S-R变异变异O-H变异变异耐药性耐药性 (最常见最常见 )毒力变异毒力变异抗原性变异抗原性变异 生物学共性生物学共性实验内容一、粪便标本中肠道致病菌的分离培养与鉴定（示教， p7375）二、大肠、伤寒、痢疾杆菌的培养及生化（示教）三、肥达试验（自做 p3940）一、粪便标本中肠道致病菌的分离与鉴定肠道致病菌与非致病菌从形态和染色难以区分，其鉴别主要依靠 生化反应 和 抗原鉴定。故肠道致病菌引起的感染通常需作分离培养，并进行生化和血清学鉴定。此外，沙门菌所致肠热症（伤寒、副伤寒）尚可采用血清学试验（肥达试验）作为辅助诊断。粪便标本或肛拭子SS琼脂平板分离培养 1824h其他生化试验：如尿素酶、吲哚试验等双糖铁培养基培养 1824h（初步鉴定）取可疑菌落血清学鉴定（玻片凝集反应）粪便标本肠道致病菌分离鉴别流程最终鉴定SS琼脂平板琼脂平板 (Salmonella shigella agar) 组成成分：组成成分：属选择性鉴别培养基 ，含选择性抑菌剂和鉴别基质。 基础成分 ：蛋白胨、牛肉膏抑制成分 ：胆盐、枸橼酸钠 抑制 G+菌生长0.1%煌绿水溶液 抑制大部分大肠杆菌生长 鉴别成分 ：乳糖、中性红水溶液鉴别 H2S：硫代硫酸钠、枸橼酸铁发酵乳糖菌落(大肠杆菌菌落呈红色）不发酵乳糖菌落（ 肠道致病菌菌落呈无色、透明）SS培养基双糖铁 -半固体培养基组成成分上层 （固体）：蛋白胨、琼脂、乳糖、硫代硫 酸纳、硫酸亚铁、酚红下层 （半固体）：蛋白胨、琼脂、葡萄糖、酚红斜面培养基 (乳糖 )半 固体培养基 (葡萄糖 )指示剂：酚红。上层： 乳糖 、 H2S下层：葡萄糖、动力Fe2+双糖铁 -半固体培养基几种肠道杆菌在双糖铁 -半固体培养基中的反应沙 门 菌 /变 形杆菌 志 贺 菌 大 肠 埃希菌斜面 Fe2+ （ H2S) +/ （固体） 乳糖 酚 红 红 色 红 色 变 黄下 层 葡萄糖 +/ + （半固体） 酚 红 变 黄 变 黄 变 黄动 力 + +尿素 酶 试验 生化反 应 进 一步 鉴 定 吲哚试验 抗原 鉴 定抗原 鉴 定 注： + 阳性或产酸； 产酸产气； -阴性 血清学鉴定：取双糖铁 -半固体培养基细菌与已知沙门菌诊断血清或志贺菌诊断血清作玻片凝集试验，对分离的肠道杆菌作进一步鉴定。沙门菌诊断血清+分离细菌生理盐水（对照）+分离细菌志賀菌诊断血清+分离细菌生理盐水（对照）+分离细菌二、大肠、伤寒、痢疾杆菌的培养和生化（示教）1、在 SS平板上的培养特性大肠杆菌（红色菌落）伤寒沙门菌（无色菌落）痢疾志贺菌（无色菌落）SS平板2、在双糖铁 -半固体培养基上的生长特点标准管 痢疾杆菌 伤寒杆菌 大肠杆菌大肠杆菌：乳糖 + 葡萄糖 + 动力 + H2S-伤寒杆菌：乳糖 - 葡萄糖 + 动力 + H2S+痢疾杆菌：乳糖 - 葡萄糖 + 动力 - H2S -乳糖 葡萄糖 H2S 动力大肠埃希菌 - + 痢疾志贺菌 - + - - 伤寒沙门菌 - + +/- + 注： + 阳性或产酸； 产酸产气； -阴性三种肠道杆菌的双糖铁 -半固体培养基培养结果原原 理理 ： 为试管凝集反应，是用已知伤寒沙门菌的菌体（ O）抗原、鞭毛（ H）抗原、甲型副伤寒沙门菌的鞭毛抗原（ A）和肖氏沙门菌的鞭毛抗原（ B）与待检血清作定量凝集试验，测定待检血清中有无相应抗体及抗体的效价，以辅助诊断肠热症。试试 剂剂 ：伤寒杆菌 O12 H 甲型副伤寒杆菌 O12 H- A肖氏沙门菌 O12 H- B希氏沙门菌 O H- 南方少见二、肥达试验 (Widal test， p39)引起肠热症的常见沙门菌的抗原组成组 菌 名 O抗原 H抗原第 1相 第 2相A组 甲型副 伤 寒沙 门 菌 1， 2， 12 a B组 肖氏沙 门 菌 1， 4， 5， 12 b 1， 2C组 希氏沙 门 菌 6， 7， Vi c 1， 5D组 伤 寒沙 门 菌 9， 12， Vi d O抗原与 H抗原的区别菌体抗原 (O-Ag) 鞭毛抗原 (H-Ag)化学成分耐热性变 异相应抗体脂多糖 蛋白质耐热 不耐热S-R变异 H-O变异IgM抗体 IgG抗体Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8NS (ml) - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Serum (ml) 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5(1:20) 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 -Antigen (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5（ O/H/A/B) Dilution 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 -37 恒温箱过夜 方方 法法0.5ml discarded为什么加抗原时应从第 8管（对照）依次由后向前加（ 8 1 ） ？ 凝集程度 以 “+”表示。 以产生明显可见凝集现象 (+)时血清的最高稀释度作为血清中抗体的效价。 O、 H凝集现象的区别：O菌液凝集物：致密颗粒状，不易摇起；H菌液凝集物：疏松棉絮状，轻摇易浮起。结果观察结果观察 ：1 2 3 4 5 6 7 8抗 O + + + + - - - -抗 H + + + + + - - - 抗 A + + - - - - - - 抗 B - - - - - - - - 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 - 结果记录结果记录 ：抗 O 1:320 抗 H 1:640 抗 A 1:40 抗 B1:40判断参考判断参考* 正常凝集价 有地区差异当 抗 O 1 ： 80抗 H 1 ： 160 有诊断意义抗 A 1 ： 80抗 B 1 ： 80结果解释结果解释抗 O增加， 抗 H增加 患肠热症可能性大抗 O、抗 H均不增加 患肠热症可能性小但要排除 假阴性单抗 O增加 感染早期、交叉