槟榔废生物碱的提取研究

化学化工学院 2009 届本科毕业论文11 前言1.1 槟榔的利用现状及前景槟榔果实为我国重要常用药材。槟榔种仁是我国四大南药（槟榔、砂仁、益智、巴戟）之一。槟榔在我国的别名众多，常用的有榔玉、仁频、宾门、槟榔子、橄榄子、青仔、洗瘴丹等等 1。槟榔性味苦、辛、温，归胃、大肠经，具有杀虫、消积、下气、行水、截疟等功效，主要用于治疗虫积食滞、脘腹胀痛、水肿、脚气、痢疾、绦虫病、胆道蛔虫、血吸虫病等，外用治疗青光眼等症。其果皮（大腹皮） 、花、花苞（大肚皮）和根等也是常用中药材。嚼食槟榔可使胃肠平滑肌张力升高，增加肠蠕动，促进消化液分泌，使食欲增加。适量食用槟榔具有一定的保健作用。成熟的果皮（榔壳）称大腹皮，主治腹胀、水肿、小便不利等症，也是轻纺工业原料，经加工后，可制成优质纤维隔板，可作塑料填充物，还可用来编织地毯等。除药用之外，其未成熟的果皮在海南、台湾、广东、云南、福建、湖南、广西等省区的一些地方，群众有咀嚼的习惯。花苞可治腹水，健胃，疗腹胀，散气滞，止霍乱。槟榔叶可编织扇子、草帽等工艺品，也可扎扫帚；果含单宁和红色染料，可分别提取栲胶和植物性色素；未成熟的果皮，也用于提取鞣料、单宁，供制皮革、染料和药用。榔干商品名称为枣槟榔，是当年 9月至翌年 1 月间采摘果实已充分生长而种仁未变硬的青果加工制成的产品。榔玉也称食用槟榔，是用 3 月以后成熟的果实加工制成的产品。将采下的果晒 23d，再用干柴文火均匀烘焙，每天翻动 1 次，约 3d 果皮变黑可取出，冷却后用锤子打破果皮取出种仁，再晒 12d 即可成榔玉。100kg 鲜果可制成 1719kg 榔玉 2。20 世纪 90 年代以前，海南槟榔主要供药用和省内人们自己嚼食，销往湖南的产品很少。1991 年后，湖南槟榔市场急剧扩大，从湘潭等地走向了湖南省各地，并扩展到了广东、江西、河北、北京、上海、浙江等 14 个省市，使食用榔干的需求量猛增。自 1994 年起，槟榔产品结构发生很大变化，从生产药用的榔玉改为生产嚼食的榔干。目前，海南省已基本上不生产药用榔玉，即使生产也大多用质量较差的残次果实加工，其量很少，远不能满足国内需求。因此需依靠进口补充。随着人们对槟榔保健功能的认可，槟榔产业的前景被广泛看好。如何发挥海南（琼）的土地、气候优势，台湾（台）的种植技术优势，湖南（湘）槟榔加工技术优势，共同打造“中国槟榔”品牌。 化学化工学院 2009 届本科毕业论文21.2 槟榔碱的性状槟榔碱，英文名：a recoline。分子式 C8H14O2N，分子量：157.2，是 一 种 黄 色 油状 液 体 ， 极 易 氧 化 ， 具 左 旋 光 性 ， 具 有 羧 基 ， 因 而 具 酸 碱 两 性 ， 可 与 水 、 乙醇 或 乙 醚 以 任 何 比 例 混 合 3。槟榔含有至少 6 种嘧啶生物碱，其中四种主要的槟榔碱为槟榔碱、槟榔次碱、次甲基槟榔碱、次甲基槟榔次碱，最常见的 4 种槟榔生物碱分子式为：槟榔碱 槟榔次碱NCH3COH3 NCOHCH3次甲基槟榔次碱 次甲基槟榔碱NHCOH NHCOH31.3 槟榔碱及其衍生物的用途槟榔碱为拟胆碱药，能使瞳孔缩小、眼内压下降，滴眼用于青光眼治疗，可作为神经系统用药和中枢神经兴奋药。槟榔碱是槟榔的有效驱虫成分，对猪肉、牛肉绦虫有较强的致瘫痪作用，对棘球蚴虫有杀伤作用，氢溴酸槟榔碱有排蠕虫效果。槟榔次碱缺少槟榔碱具有的典型拟副交感神经作用，静脉注射槟榔次碱后却对 GAGB 的活性无影响，这说明槟榔次碱本身可能无法通过血脑屏障发生作用，而槟榔次碱对中枢神经的作用可能是通过 GAGB 以外的递质系统发挥作用的。槟榔水煎液及槟榔碱纯品水溶液对上述离体胃肠标本的收缩运动均有明显的增强作用，主要表现在张力的增加和振幅的变化影响消化系统。槟榔碱亦可以抗动脉粥样硬化，防止心脑血管疾病对抗血栓形成 4。1.3.1 槟榔碱的驱虫灭螺功效槟榔碱是槟榔的有效驱虫成分，对猪肉、牛肉绦虫有较强的致瘫痪作用，对棘球蚴虫有杀伤作用，氢溴酸槟榔碱有排蠕虫效果。槟榔碱对钉螺也有杀灭作用，伺昌浩等采用 WHO 公布的“灭螺剂实验室终筛法”中的浸泡法，发现槟榔碱与化学灭螺药合用后，降低了钉螺对药物刺激的敏感性，钉螺上爬率明显降低，灭螺效果显著增强。化学化工学院 2009 届本科毕业论文3冯青等人研究表明：槟榔碱与植物灭钉螺药商陆皂甙或化学灭钉螺药五氨酚钠等联合使用，可显著降低二者的投药量。1.3.2 槟榔碱对神经系统的功效大鼠静脉注射槟榔碱后皮层处于觉醒状态，小鼠静脉注射槟榔碱则增强了活动性并增加了脑中乙酰胆碱的浓度。槟榔碱还可以通过激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴而增加内源性促肾上腺皮质激素释放激素的释放。国外新近的研究指出：槟榔碱通过类胆碱功能受体的激活作用剂量依赖性地抑制大鼠离体肾上腺体中儿茶酚胺的释放 5。槟榔次碱缺少槟榔碱具有的典型拟副交感神经作用，亦能影响小鼠的行为，可以降低小鼠的自主活动和探究行为。有研究表明：槟榔次碱和去甲基槟榔次碱在大鼠脑切片上具有 -氨基丁酸(GABA)重摄取抑制剂的活性。另一项研究采用猫脊髓切片指出槟榔次碱能够增强 GAGB 和 -丙氨酸的抑制活性，而去甲基槟榔次碱能够增加 GAGB 的抑制性而对甘氨酸的活性无影响。此研究还发现：静脉注射槟榔次碱后却对 GAGB 的活性无影响，这说明槟榔次碱本身可能无法通过血脑屏障发生作用，而槟榔次碱对中枢神经的作用可能是通过 GAGB 以外的递质系统发挥作用的 6。1.3.3 槟榔碱对消化系统的功效槟榔碱能显著提高小鼠小肠推进率，其作用机理可能与兴奋肠道平滑肌 M 受体有关。槟榔水煎液及槟榔碱纯品水溶液对上述离体胃肠标本的收缩运动均有明显的增强作用，主要表现在张力的增加和振幅的变化。类胆碱功能药物，包括乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制性物质，能促进肠内波状运动及肠内容物蠕动槟榔碱不具有抑制 AChE 的活性，槟榔碱与类胆碱作用有关的一些医学性质可能不是由于槟榔碱的存在而起作用的 7。1.4 槟榔碱的生产方法1.4.1 提取分离关于槟榔生物碱的提取，一般采用溶剂提取法。最常用的是有机溶剂提取，通常采用 75乙醇，将槟榔粉末回流提取，或用乙醚或氯仿提取，由于槟榔里生物碱与鞣酸结合在一起，所以提取时先用氨水浸。另外采用的较多的是水或酸水提取。用水或正磷酸对槟榔粉末进行回流提取。2 种方法都能较好的提取槟榔生物碱。考虑到槟榔碱极易氧化，很难得到纯品。本研究拟采用氢溴酸与渗提液中的槟榔碱反应，使之生成槟榔碱的氢溴酸盐；槟榔碱氢溴酸盐是一种白色的结晶体，比较容易分离。然后，再利用沉淀反应法脱溴，从而可以得到纯的槟榔碱。槟榔碱的含量采用设备要求相对简化学化工学院 2009 届本科毕业论文4单的分光光度法测定 8。1.4.2 测定主要采用酸性染料比色法测定槟榔生物碱的含量。生物碱盐与酸性染料形成离子对，可被氯仿定量提取，加人碱液后酸性染料游离出来。因此用比色法测定该有色溶液的吸光度，以确定生物碱含量，其过程是在槟榔生物碱的粗提液中加入酸性染料溴甲酚绿溶液，在醋酸-醋酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液中槟榔碱与这种酸性染料形成离子对，用氯仿定量提取，以氧溴酸槟榔碱为标准溶液，在 618nm 测定吸光度，此方法具有分析时间短，进样量少，分离效率高的特点。1.5 本课题研究的趋势槟榔位居四大南药之首，但是其大部分产品却不是走向药材市场，而是用于加工成人们的嗜好品商品槟榔或槟榔嚼块，用于咀嚼，槟榔的临床药理价值及保健功效没有得到充分的利用。很多学者在指出槟榔致癌的同时都忽略了槟榔嚼食行为对口腔增加的负担以及槟榔果本身粗糙的纤维对于口腔所带来的强烈机械刺激在癌症发病过程中的作用 9。所以，槟榔研究的重点应该放在对包括生物碱在内的槟榔有效成分的提取上并对其进行系统的功能评价，从生理效应验证进入到机理机制探索，以确定其生理活性或毒性，为槟榔的综合开发与利用提供一定的理论与现实依据，包括槟榔的临床新用与含有槟榔成分的食品的开发。1.6 本课题拟解决的问题大部分槟榔产品不是走向药材市场，而是用于加工成人们的嗜好品商品槟榔或槟榔嚼块，用于咀嚼，槟榔的临床药理价值及保健功效没有得到充分的利用。槟榔研究的重点应该放在对包括生物碱在内的槟榔有效成分的提取上并对其进行系统的功能评价，从生理效应验证进入到机理机制探索，以确定其生理活性或毒性，为槟榔的综合开发与利用提供一定的理论与现实依据，包括槟榔的临床新用与含有槟榔成分的(功能性)食品的开发 10。本文通过对槟榔中各种成分提取工艺的详细研究，整合各种对槟榔有用成分的提取方法和工艺，找出最大限度提取各种成分的方法和工艺，探索这种工艺的各个具体实验方法和提取条件，并对这些成分进行精制和提纯使其达到一个比较高的纯度，大大提高附加值。化学化工学院 2009 届本科毕业论文52 实验材料与方法2.1 实验仪器设备仪器名称 厂 家雷磁 pH25 酸度计 上海雷磁仪器厂722 型可见分光光度计 日本岛津公司H66025T 超声清洗机器 无锡超声电子设备厂植物粉碎机 上海洪纪仪器设备有限公司旋转蒸发仪 江阴市伟翔机械制造有限公司AL-104 电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司2.2 实验试剂试 剂 纯 度 生产产商醋酸醋酸钠 分析纯 西北化工研究院氢溴酸 分析纯 西北化工研究院硝酸银 分析纯 西北化工研究院乙醚 分析纯 西北化工研究院溴甲酚绿 分析纯 金陵石化氯 仿 分析纯 西北化工研究院氢溴酸槟榔碱 分析纯 广东汕头市西泷化工厂浓氨水 分析纯 沈阳市新城化工厂氢氧化钾 分析纯 金陵石化无水乙醇液 分析纯 金陵石化无水硫酸钠 分析纯 广东汕头市西陇化工厂蒸馏水 分析纯 实验室自制二次蒸馏水2.3 实验原理槟榔废中的生物碱成分溶于有机溶剂，所以可以用有机溶剂提取，采用无水乙醇，将槟榔粉末回流提取。化学化工学院 2009 届本科毕业论文6生物碱盐与酸性染料形成离子对，可被氯仿定量提取，加入碱液后的酸性染料游离出来因此用比色法测定该有色溶液的吸光度，以确定生物碱量。此法操作简便，灵敏度高，重现性好 11。关于槟榔生物碱的提取，学者们一般采用溶剂提取法。最常用的是有机溶剂提取，通常采用 75乙醇，将槟榔粉末回流提取，或用乙醚或氯仿提取，由于槟榔里生物碱与鞣酸结合在一起，所以提取时先用氨水浸。另外采用的较多的是水或酸水提取。用水或正磷酸对槟榔粉末进行回流提取。2 种方法都能较好的提取槟榔生物碱。槟榔里存在多种结构相似的生物碱，上述方法所提取的是槟榔的总生物碱，需进一分离和精制，才能得到单体生物碱。高敏等根据槟榔碱与槟榔次碱的氮原子间位的取代基不同而存在极性差异，将槟榔生物碱氨性乙醚提取液通过玻璃硅胶柱中分离，洗脱液为石油醚与乙酸乙酯混合液。2.4 实验流程槟榔果 壳、芯分离 槟榔壳 槟榔芯 烘干 烘干 研碎 槟榔粉末样品 无水乙醇加热回流 2h 粗提取液 回收乙醇 浓缩液 萃取浓缩 总碱粗液 加入氢溴酸 脱色 槟榔碱氢溴酸盐结晶 加入硝酸银溶液，过滤沉淀，蒸馏 槟榔碱（油状） 含量检测 结果分析，结论图 1 实验总流程图化学化工学院 2009 届本科毕业论文72.5 实验方法取研碎的槟榔废样品 100g，用无水乙醇 200ml 加热回流提取 2h，滤取提取液，残渣再如上法提取 3 次。合并 4 次提取液，回收乙醇，浓缩液放置冷却后加浓氨水调至pH=10，用四氯化碳多次搅拌提取。提取液用无水硫酸钠干燥，水浴上减压浓缩得总碱。将总碱加热溶于 50mL 无水乙醇中，放冷后滴加 W=48氢溴酸至 pH=4，用无水硫酸钠干燥后再于水浴上浓缩至 10mL，放置冰箱中，得微黄色槟榔碱氢溴酸盐结晶。将此结晶加热溶于 100mL 无水乙醇，加 10g 活性炭脱色，水浴加热回流 0.5h，过滤，活性炭用热无水乙醇洗涤 2 次，再次浓缩冷却后析出结晶，得白色槟榔碱氢溴酸盐 12。将槟榔碱氢溴酸盐加热溶于无水乙醇中，滴加质量分数为 4AgNO3，乙醇溶液(W=90乙醇，W=10水)，过滤沉淀，蒸馏可得红棕色油状槟榔碱。得到的槟榔碱溶液用于下面实验的含量测定。2.5.1 试剂的制备（1）溴甲酚绿溶液：5mgmL。低浓度的溶液以适量水稀释制得；（2）氢氧化钾无水乙醇溶液：0.O1molL。称取 28.0mg 氢氧化钾于 50mL 容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度；（3）醋酸醋酸钠缓冲液：pH=5，自制 13。2.5.2 槟榔废中生物碱的提取与分离步骤（1）槟榔果的预处理 处理流程：槟榔清洗壳、芯分离干燥粉碎。清洗好槟榔，用刀劈开，取出果芯。采用烘干的方式把槟榔的壳和芯分别干燥。（2）总碱的制备 将经过预处理的果壳与芯研碎，取研碎的槟榔样品 1kg，分批次使用，每次定量取 100g 用于实验，用无水乙醇 200ml 加热回流提取 2h，滤取提取液，残渣再如上法提取 3 次。合并 4 次提取液，旋转蒸发回收乙醇，浓缩液放置冷却后加浓氨水调至 pH 值 10.0-10.2，然后用四氯化碳多次搅拌提取。提取液加入无水硫酸钠干燥，水浴上减压浓缩得总碱 14。（3）总碱的分离 将总碱加热溶于 50mL 无水乙醇中，放冷后滴加 W=48氢溴酸至pH=4，用无水硫酸钠干燥后再于水浴上浓缩至 10mL，放置冰箱中，得微黄色槟榔碱氢溴酸盐结晶。将此结晶加热溶于 100mL 无水乙醇，加 10g 活性炭脱色，水浴加热回流0.5h，过滤，活性炭用热无水乙醇洗涤 2 次，再次浓缩冷却后析出结晶，得白色槟榔碱氢溴酸盐。（4）槟榔碱的分离 将槟榔碱氢溴酸盐加热溶于无水乙醇中，滴加质量分数为 4化学化工学院 2009 届本科毕业论文8硝酸银溶液，乙醇溶液(W=90乙醇，W=10水)，过滤沉淀，蒸馏可得红棕色油状槟榔碱。2.5.3 槟榔中生物碱的含量检测（1）制备对照品溶液 精密称取槟榔碱 10.0g，置 50ml 容量瓶中，加 pH5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液溶解并稀释至刻度，得对照品贮备液。精密吸取 10.0ml 贮备液置 50ml容量瓶中，加上述缓冲液稀释至刻度，得对照品溶液。（2）供试品溶液的制备 精密量得提取液的总体积 V，置带塞磨口锥形瓶中，精密加人浓氨水 lml 浸润 2min，加乙醚 30ml 超声振荡 20min，分取乙醚液，残渣加乙醚超声振荡 3 次，每次 10ml，各 5min，合并乙醚液低温蒸发至约 10ml，移置分液漏斗中，用 0.Olmol/L。硫酸溶液 40ml，分 4 次萃取，每次 l5、1O、l0、5ml。萃取酸水液同置20ml 容量瓶中，用 1mol/L 醋酸钠调至 pH 值为 5，摇匀，用 pH5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至刻度，即得供试品溶液。（3）吸收光谱的测定 精密吸取对照品溶液 1.0ml 置分液漏斗中，精密加人 pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液 4ml、溴甲酚绿溶液 2ml、氯仿 10m1，振摇 2min，静置 30min，分取氯仿层，置预先放有无水硫酸钠 0.2g 的干燥容量瓶中，振摇，静置，精密吸取上精液 5ml，精密加人 0.0lmol/L 氢氧化钾无水乙醇液 1ml，随行空白，扫描测定其最大吸收。（4）标准曲线的制备 精密量取定量的对照品溶液分别为1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，7.0ml，8.0ml。将这 8 个样品分别稀释至 10.0ml，稀释完成后测定样品的吸光度，记录数据，绘制标准曲线。（5）供试品溶液的浓度测定 取供试品溶液样品进行吸光度的测定，根据测定的数值对照标准曲线，既得供试品溶液的浓度 C。2.5.4 测定中的条件控制及优化（1）酸性染料用量的选择 精密吸取对照品溶液 1ml，分别精密加人0.2，0.5，0.8，1.0，1.4mg/ml 的溴甲酚绿溶液 2ml，其余同样品测定项下操作。（2）缓冲液 pH 值的选择 取 0.1mol/L 醋酸钠溶液与 0.1mol/L。醋酸溶液配制成pH 值分别为 4.7，5.0，5.3，5.6，5.9 的缓冲液。精密吸取 2ml 对照品溶液，分别精密加入不同 pH 值的缓冲液 4ml 及其配制的溴甲酚绿溶液 2ml，按样品测定项下操作 15。（3）呈色稳定性试验 精密吸取对照品溶液 1.0ml，按样品测定项下操作，每隔15min 测定其吸光度。（4）线性关系的考察 精密吸取对照品溶液 0.4，0.