金银花干叶中黄酮类物质提取工艺研究

1金银花干叶中黄酮类物质提取工艺研究【摘要】本实验以乙醇为溶剂，采用超声波法从金银花干叶中提取黄酮，并通过单因素考察和四因素三水平的正交试验确定超声波法提取金银花干叶中黄酮类物质的最佳工艺条件。同时，运用最佳工艺条件提取金银花植物各部分的黄酮并测定其含量。结果表明，最佳提取工艺是以 70%乙醇、物料比 1:10，超声波温度 60提取 20min；黄酮含量测定结果显示，金银花干花的黄酮含量比干枝、干叶和鲜枝、鲜叶高约 4-6 倍。【关键词】金银花干叶；黄酮；提取工艺；正交试验；含量测定1目 录1 前言 .12 仪器与材料 .33 实验方法 .43.1 样品预处理 .43.2 试剂配制 .43.2.1 配制芦丁标准应用液 .43.2.2 建立工作曲线 .43.3 总黄酮的测定 .53.3.1 铝配合物分光光度法 .53.3.2 样品总黄酮含量测定 .53.4 单因素试验 .53.4.1 乙醇浓度对提取效果的影响 .53.4.2 超声波提取时间对提取效果的影响 .53.4.3 料液比对提取效果的影响 .53.4.4 超声波仪温度对提取效果的影响 .63.5 正交试验 .64 结果与分析 .74.1 总黄酮的测定 .74.1.1 绘制标准曲线 .74.2 单因素试验结果 .84.2.1 乙醇浓度对提取效果的影响 .84.2.2 超声波提取时间对提取效果的影响 .84.2.3 料液比对提取效果的影响 .94.2.4 温度对提取效果的影响 .104.3 正交试验结果 .104.4 金银花各部分的黄酮提取与含量测定 .124.4.1 实验方法 .124.4.2 结果与分析 .135 结论与展望 .14参考文献 .1511 前言金银花是我国传统的中药植物，具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆等功能，是主治痈肿疔疮喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热的常用药材。 1金银花叶中的黄酮类化合物有木犀草、 忍冬苷等。经研究表明, 不同时期的金银花修剪各部位均含有黄酮,节部和叶片含量最高，花中次之，茎中含量较低 2。金银花越冬老叶中黄酮含量约为药用金银花的 2.78 倍、忍冬藤的 6.98 倍。 3黄酮上述分布特征提示了金银花叶和节部可能是较好药用部位，但是金银花叶片一直被视为非药用部位而长期未得到充分利用。根据我国 16 各省市和自治区的 158 个市、县的 202 个金银花商品样品的研究，共鉴定出其原植物分属于忍冬属 14 个种 1 个亚种和 2 个变种，其中以忍冬分布最广、质量最高。金银花的产量以山东省最丰，品质则以河南省为上乘。河南、山东是金银花的传统和地道产地。 4根据上述文献资料，可见金银花枝叶的药源比金银花丰富，分布广泛并且采集容易，价格相对便宜，应该充分利用。黄酮类化合物(Flavonoid)，又称生物类黄酮，广泛存在于自然界中，约1/4 的植物中含有黄酮，已知化学结构的黄酮类化合物近 5000 种，其数量居天然酚类物质之首，广泛存在于植物的各个部位，主要存在于芸香料、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。据研究，约 20%的中草药中含有黄酮类化合物，来源非常广泛。 5黄酮具有抗癌防癌、延缓衰老、增强心血管功能、增强机体免疫功能、抑菌抗病毒和抗炎镇痛等药理活性，是多种中药材的有效成分。我国研究的 124 种防治气管炎药物中，就有 69 种含有黄酮类化合物，黄酮类化合物的作用比较温和,在治疗心血管系统和慢性气管炎等新药的寻找方面占一定地位。 6在食品工业中，黄酮类物质还可以作为抗氧化剂、天然色素和甜味剂使用。有关文献对桑叶、银杏、葛根、竹类、水芹及大豆等植物黄酮提取工艺的研究成果较多，但是金银花枝叶提取黄酮的工艺研究成果较少。本实验探讨了金银花干叶中黄酮类物质的最佳提取工艺，以求为金银花植物进一步开发利用提供理论依据。22 仪器与材料金银花干叶、干枝、鲜叶、鲜枝、干花；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠；蒸馏水；芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)；试剂瓶；胶头滴管；150ml 具塞三角瓶；25ml 具塞比色管；100ml 容量瓶；500ml 抽滤瓶；玻璃棒；移液管（0.5ml、1ml、2ml、5ml） ；漏斗；比色管架；KQ-500E 型超声波清洗器；V-1200 型紫外可见分光光度计；真空抽滤泵等（试剂均为分析纯） 。3 实验方法3.1 样品预处理金银花干枝、干叶和干花样品用粉碎机粉碎，过 60 目筛干燥保存备用，鲜枝、鲜叶样品在使用前用粉碎机粉碎，不可长时间保存应现制现用。3.2 试剂配制本实验需要使用 50g/L 的亚硝酸钠溶液、100g/L 的硝酸铝溶液和 10g/L 的氢氧化钠溶液。具体配制方法如下：称取 5.0g 亚硝酸钠，用水溶解后定容到100ml 即可得到 50g/L 的亚硝酸钠溶液，保存于试剂瓶中备用；称取 10.0g 硝酸铝，用水溶解后定容到 100ml 即可得到 100g/L 的硝酸铝溶液，保存于试剂瓶中备用；称取 10.0g 氢氧化钠，用水溶解后定容至 1L 即可得到 10g/L 的氢氧化钠溶液，保存于非磨口试剂瓶中备用。3.2.1 配制芦丁标准应用液称取 0.2000g (精确至 0.0002g）芦丁对照品（已知质量分数大于 99.0)，置于 100ml 容量瓶中，用乙醇溶液（体积分数为 60%)溶解并定容至刻度，摇匀，即可制得 2.00mg/ml 的芦丁标准贮备溶液。吸取 10.00ml 芦丁标准贮备溶液于 100ml 容量瓶中，用水定容至刻度即可制得0.20mg/ml 的芦丁标准应用溶液，临用现配。33.2.2 建立工作曲线吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml芦丁标准应用溶液相当于0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg无水芦丁，分别置于25ml具塞比色管中，补水至约10ml， 加1.0ml亚硝酸钠溶液混匀，放置6min；加1.0ml硝酸铝溶液混匀，放置6min；加4.0ml氢氧化钠溶液，再加水至刻度，摇匀，放置15min。用1cm比色皿，以试剂空白调节零点，在波长510nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,芦丁的浓度为横坐标，绘制工作曲线和计算回归方程。3.3 总黄酮的测定3.3.1 铝配合物分光光度法在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，溶于乙醇的黄酮类化合物与铝盐生成螯合物，加氢氧化钠溶液后显红色，在510nm波长附近达到最大吸收，与芦丁标准系列比较定量。 73.3.2 样品总黄酮含量测定吸取2.00mL样品溶液两份，分别置于25ml具塞比色管中,补水至约10ml。以下步骤按标准曲线操作，其中一份不加硝酸铝溶液，做样品空白。显色后用滤纸过滤，弃去初滤液，收集滤液备测。以试剂空白溶液调节零点，在波长510 nm处测吸光度，测得样品吸光度减去样品空白吸光度，用回归方程计算样品溶液中总黄酮的质量。3.4 单因素试验3.4.1 乙醇浓度对提取效果的影响称取3 g经过干燥粉碎的金银花叶5份，按1:15 8加入体积分数为50、60、70、80、90的乙醇，于40 8下超声波仪超声提取30min 8。抽滤，并用相应浓度的乙醇溶液反复冲洗提取容器和抽滤瓶将冲洗液并入滤液中，用相应浓度的乙醇定容至100ml，取样测定吸光度。3.4.2 超声波提取时间对提取效果的影响称取3 g经过干燥粉碎的金银花叶5份，按1:15 8加入60的乙醇，于408下超声波仪震荡10min，20min，30min，40min，50min提取。抽滤，并用相应浓度的乙醇溶液反复冲洗提取容器和和抽滤瓶将冲洗液并入滤液中，用60%的乙醇定容至100ml，取样测定吸光度。43.4.3 料液比对提取效果的影响称取 3 g 经过干燥粉碎的金银花叶 5 份，按 1:10,1:15,1:20,1:25,1:30 加入 60的乙醇，于 40 8下超声波仪震荡 30min 提取。抽滤，并用相应浓度的乙醇溶液反复冲洗提取容器和和抽滤瓶将冲洗液并入滤液中，用 60%的乙醇定容至 100ml，取样测定吸光度。3.4.4 超声波仪温度对提取效果的影响称取 3 g 经过干燥粉碎的金银花叶 5 份，按 1:15 加入 60的乙醇，分别于 40，50，60，70，80下超声波仪震荡 30min 提取。取样测定吸光度。抽滤，并用相应浓度的乙醇溶液反复冲洗提取容器和和抽滤瓶将冲洗液并入滤液中，用 60%的乙醇定容至 100ml，取样测定吸光度。3.5 正交试验在实际提取操作中，各因素间可能存在交叉影响，最佳提取条件可能不是各个单因素的最佳水平的简单组合。因此，应以单因素考察结果为基础确定正交水平因素表，同时以影响提取效果的 A（乙醇浓度% ） ，B（超声波时间 min） ，C（料液比 g/ m L) ， D （提取温度 ）四个因素为自变量，总黄酮含量（%）为响应值，作四因素三水平的正交试验，根据正交试验结果确定最佳提取工艺。4 结果与分析4.1 总黄酮的测定4.1.1 绘制标准曲线芦丁标准品的吸光度测定结果如表-1，以吸光度为纵坐标,芦丁的浓度为横坐标绘制得到工作曲线如图-1，并且计算得回归方程：y=12.218x-0.0105 （R 2 =0.9978） 。表-1 芦丁对照品吸光度测定结果 芦丁标准溶液体积（ml） 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 5芦丁浓度（mg/ml） 0.000 0.008 0.016 0.024 0.032 0.040相当于芦丁质量（mg） 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00吸光度 0.000 0.085 0.177 0.273 0.380 0.488 y = 12.218x - 0.0105R2 = 0.9978-0.100.10.20.30.40.50.60 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05芦丁浓度 (mg/ml)A图-1 芦丁标准曲线4.2 单因素试验结果4.2.1 乙醇浓度对提取效果的影响如图-2 显示，乙醇浓度为 60%时黄酮的提取率最高。乙醇浓度在 50% 70%时，有较高的黄酮提取率。乙醇浓度大于 70%以后，黄酮提取率大幅度降低。较高乙醇浓度有利于提高黄酮提取率，但高浓度乙醇使其他醇溶性杂质的溶出增多，有效成分溶出减少。 9因此乙醇浓度因素的最佳水平为 60%。05101520253050% 55% 60% 65% 70% 75% 80% 85% 90% 95%乙醇浓度 （%）黄酮含量（ mg/g） 图-2 乙醇浓度对提取效果的影响64.2.2 超声波提取时间对提取效果的影响如图-4 显示，10-30min 黄酮的提取率随提取时间增加而呈增加趋势，当提取时间为 30min 时，黄酮的提取率最高，30-50min 黄酮的提取率随提取时间的增加而呈减少趋势。因为提取溶剂乙醇的挥发程度与温度和时间呈正相关。提取时间为 10-30min 时乙醇的挥发程度较小，黄酮提取率呈上升趋势；而提取时间为 30-50min 时乙醇的挥发程度较 10-30min 时大，所以黄酮提取率反而下降。因此提取时间单因素的最佳水平为 30min。2222.52323.52424.5250 10 20 30 40 50 60超声时间（min）黄酮含量（mg/g）图-3 超声波时间对提取效果的影响4.2.3 料液比对提取效果的影响提取过程是指被提取物在片状或颗粒状表面与溶剂反应的过程，一方面提取液比例的提高增加了料液体系间的有效成分浓度差，减少内部残留量，超声波可以强化其水合过程，当提取物表面与溶剂的接触充分，空化效应形成的微射流和局部热点对物质结构的不断破坏以增加与溶剂的接触面积，从而提高了提取率。 10-11图-5 显示，料液比为 1:10,1:15,1:25 时黄酮提取率相对较高，当料液比为 1:15 时黄酮提取率最高，因此料液比单因素的最佳水平是 1:15。705101520253035400 110 115 120 125 130 135料液比（ g/ml）黄酮含量（ mg/g）图-4 料液比对提取效果的影响4.2.4 温度对提取效果的影响如图-6 显示随着提取温度升高，黄酮的提取率呈上升趋势，提取温度为60时提取率达到最大。黄酮类物质含有酚羟基使其具有很强还原性，温度过高会加速黄酮类物质氧化 12，因此提取温度单因素的最佳水平为 60。051015202530354020 25 30 35 40 45 50 55 60 65温度（）黄酮含量（mg/g）图-5 温度对提取效果的影响4.3 正交试验结果由单因素考察实验结果，可得正交试验因素水平表如表-3 所示，根据正交因素水平表进行正交试验，其结果如表-4 所示。表-2 正交试验因素水平表因素水平 A B C D乙醇浓度(%) 超声波时间(min) 料液比(g/ml) 提取温度()81 50 10 110 402 60 20 115 503 70 30 125 60表-3 正交试验结果处理号 A B C D Abs 乙醇浓度 超声波时间 料液比 提取温度 吸光度 总黄酮含量（%） （min） （g/ml） （） （mg/g）1 50 10 110 40 0.208 29.82 50 20 115 50 0.211 30.23 50 30 125 60 0.265 37.64 60 10 115 60 0.220 31.35 60 20 125 40 0.204 29.36 60 30 110 50 0.227 32.47 70 10 125 50 0.239 34.08 70 20 110 60 0.27