双水相萃取技术的研究进展及应用

双水相萃取技术的研究及应用宋平（华中农业大学生命科学技术学院应用生技 0801 班）摘要：双水相萃取技术(aqueous two-phase extraction technique,ATPE)是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。它与传统的萃取方法相比有独特的优点，由于双水相萃取分离过程条件温和，可调节因素多,易于放大和操作，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。目前,双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域，被认为是生物下游工程中一种具有广阔应用前景的分离技术。本文综述了双水相萃取技术基本原理、特点及应用，并对双水相萃取技术存在的问题和发展趋势作了论述。关键词：双水相萃取技术；分离纯化；应用The research and application of aqueous two-phase extraction technologySONG Ping（Class of Applied biotechnology 0801，College of life science and biotechnology，Hua Zhong Agriculture University）Abstract: Aqueous two-phase extraction technique is a technology of separation and purification by using the differences of components distribution between two-phaseCompared with the traditional extraction method，it has unique advantagesDue to process under mild conditions, having many factors which can be adjusted, easy to zoom in and operate,having no organic solvent residue problems,and can use the traditional solvent extraction of the relevant theory and experience,ATPE is especially suitable for the separation and purification of biological substances. Currently, the two-phase extraction technique has been widely used in medicinal chemistry, cell biology, chemical and food industry and other fields, is considered a biological downstream engineering and has broad application prospects of the separation. In this paper, basic principles, characteristics and application of aqueous two-phase extraction technique and the problems and trends were discussed.Keyword: Aqueous two-phase extraction technique; separation and purification;application随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开，各种生化新产品不断涌现，但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的，对分离条件以及环境要求极其苛刻，使得传统的液液萃取已不能适应分离要求，因此一种新型的液液分离技术双水相萃取(A queous two-phase extractien，ATPE)技术应运而生。双水相萃取技术是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。由于双水相萃取分离过程条件温和,可调节因素多,易于放大和操作，并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验，不存在有机溶剂残留问题，特别适用于生物物质的分离和提纯。 【1】 （徐长波和王巍杰，2009）目前，双水相萃取技术已实现了细胞器、细胞膜、病毒等多种生物体和生物组织及蛋白质、酶、核酸、多糖、生长素等大分子生物物质的分离与纯化，取得了较好的成效。近年来，双水相萃取技术的分离对象进一步扩大，已经包括了抗生素、多肽和氨基酸、重金属离子和植物有效成分中的小分子物质。 2(田瑞华，2008)1 双水相萃取技术在生物分离工程中的应用双水相萃取现象最早是1896年由Beijerinck在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的，被称为“聚合物的不相溶性”。本世纪60年代瑞典Lund大学的Albertsson P A及其同事们最先提出双水相萃取技术并做了大量工作。70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取效果。二十世纪八十年代以后双水相萃取技术开始了工业上的应用。表一为近年来双水相萃取技术的部分应用实例。表一 双水相萃取技术在生物分离工程中的应用分离物质 实例 体系从奶酪中分离 乳球蛋白 PEG磷酸盐蛋白质从转基因羊乳中纯化药物蛋白 PEG硫酸铵从细胞培养液中提取脂肪酶 PEG磷酸盐从发酵液中分离提取 -淀粉酶和蛋白酶 PEG硫酸铵酶从发酵液中提取葡聚糖苷酶 PEG硫酸铵核酸 RNA 的分离 PEG葡聚糖从全发酵液萃取丙酰螺旋霉素 PEG磷酸盐抗生素从发酵液中提取青霉素 PEG硫酸铵牛膝高分子物质中多糖成分的纯化 PEG磷酸盐微生物牛乳糖的纯化 PEG磷酸盐多糖线性和环状低聚糖的分离 PEG磷酸盐植物有效成分 从黄芩中提取黄芩素 PEG磷酸盐EOPO水色素 从大肠杆菌中提取细胞色素 b5 PEG硫酸铵抗体 从禽卵黄中提取 IgG 抗体 PEG磷酸盐注：PEG是指聚乙二醇( poly ethylene glycol，PEG)EOPO是指环氧乙烷（EO）和环氧丙烷(PO)的随机共聚物2 双水相萃取的基本原理 3（严希康，2000）双水相萃取与一般的水-有机物萃取的原理相似。都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同，物质进入双水相体系后，由于分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之间电荷的作用，目标物质在上、下相中的浓度不同，从而达到分离的目的。溶质( 包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以及贵金属的络合物、中草药成分等) 在双水相体系中服从Nernst分配定律:K= Ct / Cb其中c t 、c b 分别代表溶质在上相、下相中的浓度。系统固定时，分配系数为一常数，与溶质的浓度无关。当目标物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的分配系数都大于100或者小于0.01，因此为物质分离提供了可能。3 双水相萃取体系的特点双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备，并在温和条件下进行简单操作就可获得较高收率和纯度的新型分离技术。与一些传统的分离方法相比，双水相萃取技术具有以下独有的特点：( 1) 两相间的界面张力小，一般为10 - 710- 4mNm- 1 ( 一般体系10 - 3210- 2mNm- 1 )，因此两相易分散，而且它比一般的有机萃取两相体系界面张力低的多，这样有利于强化相际间的物质传递。( 2) 操作条件温和，由于双水相的界面张力大大低于有机溶剂与水相之间的界面张力，整个操作过程可以在常温常压下进行，对于生物活性物质的提取来说有助于保持生物活性和强化相际传质。( 3) 双水相体系中的传质和平衡速度快，回收率高，分相时间短，传质过程和平衡过程速度均很快，自然分相时间一般为515min，因此相对于某些分离过程来说，能耗较低，而且可以实现快速的分离。( 4) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉，与其他常用固液分离方法相比，双水相分配技术可省去12 个分离步骤，使整个分离过程更经济。( 5) 含水量高，一般为75%90%，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性。( 6) 一般不存在有机溶剂的残留问题，现已证明形成双水相的聚合物( 如PEG) 对人体无害，可用于食品添加剂、注射剂和制药，因此对环境污染小。( 7) 聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度，以及体系的pH值等因素都对被萃取物质在两相间的分配产生影响，因此可以采用多种手段来提高选择性和回收率。( 8) 易于连续化操作，设备简单，并且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理。例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。( 9) 分配过程因素较多，可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。 4(马春红等，2010)4 双水相萃取技术的相关进展4.1 在生物工程中的应用双水相技术作为一种生化分离技术，由于其条件温和,易操作，可调节因素多，并可借助传统溶剂萃取的成功经验，而被认为是一种生物下游工程初步分离的单元操作。曹对喜等 5(曹对喜，2010)采用聚乙二醇（PEG） / 硫酸铵（(NH 4)2SO4 ） 双水相体系从番木瓜汁中提取木瓜蛋白酶。探讨了PEG 分子量、PEG 质量分数、（NH 4)2SO4质量分数、pH 值以及粗酶添加量对木瓜蛋白酶萃取的影响，结果表明，在PEG （分子量6 000） 质量分数为22.0%，NH 4)2SO4为14.6%，pH 值为5.0，粗酶添加量为7.5%所组成的双水相体系下，可获得酶活收率89.30%，纯化倍数2.02，提取的木瓜蛋白酶比酶活达到3 639 U/mL。文赤夫等 6(文赤夫等，2009)研究双水相萃取橙皮苷的成相体系及影响萃取率的因素。通过试验研究选择丙酮与(NH 4)2SO4-H2O 为双水相体系，研究盐用量、pH 值及粗提物的用量对萃取率的影响。结果表明：在90% 丙酮与(NH 4)2SO4 溶液体积各为10ml 的情况下，(NH 4)2SO4 用量4.0g、样品0.35g、pH4 的条件下，萃取效率最佳。经萃取，橘皮中的橙皮苷主要进入有机相中，萃取率为98.22%。通过薄层分析，在365nm 紫外灯下，上相溶液与标准品的斑点Rf 值接近，下相溶液检测不到橙皮苷。刘晶晶等 7(刘晶晶等，2010)用双水相萃取的方法对甜菜红色素粗提液进行纯化。采用酸性水溶液从甜菜块根中浸泡提取甜菜红色素，得到色素粗提液,然后调整pH值，加入聚乙二醇和硫酸铵形成双水相系统，进行充分的混合萃取，静置后形成两相，甜菜红色素进入聚乙二醇上相，糖类杂质进入硫酸铵下相。上相采用超滤膜法将甜菜红色素和聚乙二醇分离开，甜菜红色素采用反渗透或纳滤膜进行浓缩，然后再真空浓缩至固含量20以上，最后采用喷雾干燥的方法得到甜菜红色素产品。4.2 在发酵工程中的应用由于发酵液中成分比较复杂，目标产物含量低，而传统的分离纯化方法步骤繁琐，导致产品回收率低，成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相体系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究，并取得了一些成绩。焦庆才等 8(焦庆才，1998) 应用PEG硫酸铵双水相系统对发酵液粗滤液直接进行萃取处理， 通过试验确定了分离提取-淀粉酶和蛋白酶的最佳萃取条件。游见明等 9(游见明，吕开斌，2009) 用双水相萃取方法对直接从发酵液中提取柚苷酶进行了实验，就聚乙二醇- 硫酸铵双水相系统中的聚乙二醇相对分子量、聚乙二醇浓度、硫酸铵浓度、无机盐的添加等因素对柚苷酶的分配行为的影响进行了探索。结果显示: 在用浓度为14% 16%的PEG1000与浓度为14% 18%硫酸铵和0.1%氯化钠组成的双水相体系中，柚苷酶的分配系数达1.85以上, 酶活力回收率达80%, 提纯倍数为2.1。刘国兴等 10(刘国兴等，2009) 实验考察了乙醇/ 碳酸钾双水相萃取盾叶薯蓣发酵液中2 ,3-丁二醇的分配情况，并对其工艺条件进行了优化。结果表明，当乙醇22 % (质量) 、碳酸钾26 % (质量) 时, 发酵液中2 ,3-丁二醇的回收率达到最高值97 % ，此时， 乙偶姻和残余还原糖的回收率为97 %和87 %，菌体和蛋白的去除率分别为99 %和94 %，而丙酮酸、柠酸、苹果酸、延胡索酸和琥珀酸的去除率高达100 %，这为2 ,32丁二醇的工业分离提供了一种新的技术。苏玉春等 11(苏玉春等，2009) 采用双水相法从黑曲霉AS3.4309 的发酵液中提取木聚糖酶，通过正交试验对双水相的组成进行优化。结果表明，双水相体系最佳组成为：选用PEG4000，其浓度为19%(W/W)，磷酸氢二钾浓度为10%(W/W)，氯化钠浓度为0(W/W)。此条件下，木聚糖酶的提取效果较好，分离系数(K)和上相产率(Yt)分别为6.23 和88.67%。余红英等 12(余红英等，2003) 研究了聚乙二醇(PEG)平均相对分子质量、PEG 浓度、(NH 4)2SO4浓度、NaCl 浓度对-甘露聚糖酶和总蛋白分配系数、相体积比和萃取率的影响。实验表明PEG1000 20% ( m /m ) 和(NH 4)2SO415% (m/m )，NaCl 为2% ( m/m ) 组成的双水相体系，室温下直接对含菌体的枯草芽孢杆菌发酵液抽提B2甘露聚糖酶，可纯化2. 76 倍，萃取率达98. 79%。4.3 在药物方面的应用自1990年以来，一些用双水相萃取小分子生物活性物质的文章相继报道，打破了认为双水相萃取只能用于生物大分子和细胞等物质分离的观点，这也使得双水相萃取技术在药物领域的应用更加的广泛了。丙酰螺旋霉素(propionylspiramycin，PRO-SPM)是一新大环内酯类抗生素, 曾以溶媒法和大网格树脂吸附法进行了提取和分离, 秦德华等 13(秦德华等，1998)对用双水相萃取技术萃取PRO-SPM 作了探讨, 研究了各种因素对萃取的影响, 并比较了用ATPE技术萃取PRO-SPM溶液与PRO-SPM发酵液的差异。根据数据提出在PRO-SPM的双水相萃取过程中疏水作用是影响萃取的主要因素，与蛋白质以静电效应为主不同。用发酵液进行放大试验并与溶媒法进行比较，ATPE法萃取收率提高了32%，而纯度有所下降。谢涛等 14(谢涛等，2008)首创的研究了以聚乙二醇（PEG）和K 2HPO4 构成的双水相萃取体系用于三七浸提液中三七皂苷的提取分离，获得较好的实验结果。在选定的条件下，即PEG分子量为4000，pH为4.25.0，浸液萃取剂比值为12，PEG盐的质量比为11，三七总皂苷收率达96%以上。李梦青等 15(李梦青等，2006) 研究了双水相萃取体系在提纯白藜芦醇工艺中的应用，用乙醇-硫酸胺-水双水相体系使虎杖提取液中的各物质按极性不同在油水两相中得到分离。双水相萃取时,白藜芦醇的含量远高于有机溶剂萃取，达34. 29 %。可见双水相技术可以完全代替有机溶剂萃取技术提纯白藜芦醇，产品纯度高，并且具有工艺简单,，毒性小，成本低等优点。赵爱丽等 16(赵爱丽等，2008)利用聚乙二醇(PEG) /K 2HPO4 - H2O双水相体系对黄芩苷进行分离纯化，结果表明双水相中PEG的分子量、PEG浓度、K 2HPO4 浓度、pH值及温度等因素都对双水相体系的相比、分配系数及黄芩苷的收率有一定影响，在最佳分离条件下,黄芩苷最大的分配系数可达29. 8，最大收率98. 6%。黄芩苷大部分被分配在PEG相(上相)中。葛根素具有扩张冠状动脉、降低血压、抗心率失常、改善微循环、降血糖等功效，是重要的心脑血管治疗用药。霍清 17（霍清，2006）对葛根素在双水相体系中的分配特性进行了研究。实验表明,采用聚乙二醇( PEG) / (NH 4 ) 2 SO4 双水相体系时，最大的分配系数可达148. 2,最大收率99. 09%。采用丙酮/K2HPO4 双水相体系时，最大的分配系数可达36. 7143，,最大收率99. 55%，葛根素大部分被分配在丙酮相(上相)中。甘露醇是我国名贵中药材虫草重要活性成分之一，该药材具有补肺益肾，化痰止血之功效，可治疗多种疑难杂症。现代药理实验又证明其具有扩张支气管，控制心跳，镇静催眠等作用，还具有抗癌活性和抑制病菌，提高机体免疫功能等作用。陈毅坚等 18(陈毅坚等，2008)探索采用正丙醇/(NH 4)2SO4双水相系统从拟黑虫草发酵液中提取甘露醇的方法。实验研究了正丙醇、(NH 4)2SO4、溶液浓度和pH 值对甘露醇分配系数、萃取率的影响，确定提取甘露醇的最佳条件，即正丙醇溶液浓度为20%、(NH 4)2SO4溶液浓度为25%、pH7.4 时分配系数为0.028，甘露醇萃取率最高为73.79%。5 双水相萃取技术的局限和未来双水相萃取技术作为一种新型的分离技术，可以利用不复杂的设备、并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分，克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，在萃取过程中保持生物物质的活性及构象等明显的技术优势，并且取得了一些阶段性的成果，在生物工程、药物分析、金属分离等方面有着广阔的应用前景。然而，有关双水相的应用和研究还不够，一些技术难题还有待于解决。如：易乳化、相分离时间长，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物大多数粘度较大，不易定量控制；水溶性的高聚物难以挥发，使反萃必不可少，高聚物回收困难等等。今后，随着对双水相体系研究的深入，以及其他双水相体系的不断开发，例如离子液体双水相体系，其形成机理，热力学模型、动力学模型以及工艺技术等方面的问题最终会被突破和解决，其应用领域将进一步拓宽，双水相萃取将会成为一种优良的分离技术。【1】 徐长波，王巍杰，双水相萃取技术研究进展，化工科技，2009，Vol.38，No.5：40-44【2】 田洪涛，马晓燕双水相萃取见：田瑞华主编，生物分离工程北京：科学出版社，2008，79-80【3】 严希康，余俊棠，双水相萃取.见：严希康编著，生物分离工程北京：化学工业出版社，2000，169-174【4】 马春宏，朱红，王良，姜大雨，闫永胜，王庆伟，双水相萃取技术的应用研究进展，光谱实验室，2010，Vol.27，No .5：1906-1914【5】 曹对喜，杜征，韩玉婷，余丽萍，刘坤逊，陈玉莹，段杉，双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究，农产品加工学刊，2010-10，No.10：66-69【6】 文赤夫，赵凯，康练常，汪兰，双水相技术在萃取橙皮苷中的应用