白细胞介素

白细胞介素,1,白细胞介素：,白细胞介素即是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。目前至少发现了38个白细胞介素，分别命名为IL-1IL38，功能复杂，成网络，复杂重叠;在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病例反应。,2,白细胞介素的由来：,白细胞介素（interleukin,IL）最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子，虽然后来发现白细胞介素可由其他细胞产生,也可作用于其他细胞，这一名称仍被沿用。在1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上，白细胞介素将来自单核-巨噬细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子称为白细胞介素（interleukin，IL）。,3,显微镜下的白细胞介素,4,白细胞介素的分类,IL-1：又称淋巴细胞刺激因子。IL-2：又称T细胞生长因子，TCGFIL-3：又称为多能集落刺激因子（multi-csf）。IL-4：由抗原或丝裂原刺激的cd4+t细胞产年，活化的肥大细胞亦可产生il-4。IL-5：由抗原活化的cd4+t细胞产生；肥大细胞也能产生il-5。IL-6：可由多种细胞合成，包括活化的t细胞和b细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。,5,白细胞介素的分类,IL-7 ：il-7是由骨髓基质细胞分泌的糖蛋白，分子量为25kd；其基因位于第8号染色体。IL-8 ： il-8主要由单核巨噬细胞产生；其他如成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞等亦可在适宜的刺激条件下产生il-8。IL-9：细胞来源：il-9主要是由th细胞产生，在人和实验鼠的体内都可以自我合成。IL-101、细胞来源：il-10的分子量为3540kd，通常为二聚体；主要由th2细胞产生，也可由单核细胞、角质细胞及活化的b细胞产生。,6,白细胞介素的分类,IL-11：il-11由骨髓基质细胞产生，分子量约为23kd，是造血微环境中一个多功能的调节因子。IL-12：il-12主要由b细胞和巨噬细胞产生；其分子是一种异型二聚体，40kd（p40）和35kd(p35)的2个亚基通过二硫键相连接。IL-13:细胞来源：il-13由th2细胞产生，分子量约10kd；其基因位于第5号染色体上，与il-4基因紧密连接。il-13分子的氨基酸顺序与il-4有2025的同源性，在功能上也与il-4有许多相似之处。,7,白细胞介素的分类,IL-14;il-14由t细胞分泌，其成熟形式含468个氨基酸残基，可刺激活化的b细胞增殖，抑制丝裂原诱导的b细胞分泌免疫球蛋白。IL-15：il-15是新发现的一种因子，可由活化的单核巨噬细胞、表皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生。,8,白细胞介素2(IL-2),细胞来源：主要由T细胞产生。又称T细胞生长因子。作用方式：以自分泌和旁分泌方式发挥效应。主要生物学功能：（1）活化T细胞，促进细胞因子产生（2）刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生。（3）促进B细胞增殖和分泌抗体。,9,白细胞介素2生产工艺流程,发酵工程菌为大肠杆菌。种子用LB培养基；发酵用M9CA培养基，3010小时，后提高温度至42，诱导3小时。,10,分离纯化,包涵体制备： 离心收集，菌体悬于EDTA溶液中，用超声波破碎细胞，后8000r/Min离心，收集沉淀（包涵体和细胞碎片）,11,包涵体洗涤及裂解,用Tris-HCL洗涤3次，离心收集沉淀，用盐酸胍变性，离心收集上清液。凝胶过滤及复性：上清过Sephacryl S-200柱，醋酸液洗脱，收集洗脱峰。干燥：冷冻真空干燥。,12,目标基因克隆,研究内容,研究方法,工程菌构建流程,13,工程菌构建的目标,获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。,14,大肠杆菌构建技术,15,大肠杆菌,细胞：G，单细胞，杆状。鞭毛、无芽孢、一般无荚膜。裂殖。 菌落:白色至黄白色，光滑，直径23mm。,16,大肠杆菌构建技术,1.PCR扩增PCR (Polymerase chain reaction)聚合酶链式反应：在DNA聚合酶催化下，对特定的DNA序列进行的复制反应 本质：生物体DNA复制原理在体外合成DNA 发明者：Mullis，生物技术革命的象征，1993年获得诺贝尔奖,17,2.酶切反应,概念：在特异位点上催化dsDNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 酶切体系组成：目标和质粒DNA，缓冲液，限制性内切酶。 反应条件：适宜温度(37)，1小时以上。 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 电泳检查：酶切完全性。,18,3.连接反应,概念：DNA 双链上相邻的3-羟基和5-磷酸基因共价结合形成3-5-磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。 连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。 连接反应：16-26，数小时，或过夜。 终止反应：在70加热10分钟。,19,4.转化,转化：把外源基因导入宿主细胞的过程；某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象,20,大肠杆菌转化法- CaCl2法,感受态细胞制备： 将培养液转入离心管中，冰上放置10 分钟，然后于4下离心10 分钟。 弃去上清，用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 分钟后，4下，离心10 分钟。 加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。 热击：42，90s； 置冰上，12分钟。 扩增培养：加入LB培养基，37，45分钟。 涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。 筛选培养：37，出现菌落。,21,5.筛选与鉴定,转化后的细胞类型 非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞 转化子：导入外源DNA的转化细胞 非重组子：仅含有空载体分子的转化子 重组子：含有重组DNA分子的转化子 目标重组子：含有连接正确的重组分子（目的） 非目标重组子：不含目的基因重组子,22,筛选方法,抗生素筛选法： 抗生素的抗性基因|氨苄青霉素,23,筛选方法,篮白斑筛选法： lacZ基因，重组子白色，非重组子蓝色。培养基中含X-galX-gal: 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 -半乳糖苷酶可以把培养基中无色的X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，使菌落成蓝色,24,鉴定方法,菌落PCR：含有目标基因 载体大小：电泳检测 酶切鉴定：目标基因插入及插入方向 测序确证：目标基因的序列准确无误,25,工程菌构建的质量控制,为了确保工程菌构建的有效性，必须遵循GMP及其有关生物制品研究技术指导原则，做好菌种的纪录和管理。,26,温度对工程菌产物合成的影响,生长与生产温度不一致 较高温度表达量达，易形成包涵体 策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质 对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏 策略：生产期可采用先高温，后低温，变温表达，避免蛋白质降解例如： 大肠杆菌和酵母生长最低温度为10 大肠杆菌生长最适温度为37，最高温度为45 酿酒酵母：生长最适温度为30