微生物遗传2017演示文档

.,曹理想中山大学生命科学学院,第七章 微生物的遗传变异和育种,.,人类流感大劫难档案,公元前412年，“现代医学之父”古希腊的希波克拉底就已经记述了类似流感的症状。1580年，菲利普二世统治西班牙期间，才有明确的流感大流行的记录。 1658年，意大利威尼斯城的一次流感大流行使6万人死亡，惊慌的人们认为这是上帝的惩罚，所以将这种病命名为“Influenza”，意即“魔鬼”。 1742年至1743年，由流行性感冒引起的流行病曾影响90%的东欧人。 1837年1月，在欧洲暴发的流感非常严重，在柏林，流感造成的死亡人数超过了出生人数；巴塞罗那所有的公共商业活动停止。 1889年1894年，这几年发生的流感席卷了整个西欧，发病广泛，死亡率高，造成严重影响。,.,1918年，世界上暴发了历史上最著名的严重流感大流行“西班牙流感”。1957年，暴发了“亚洲流感”(病毒类型H2N2)，全球仍然有200多万人遭遇厄运。 1968年7月，由甲型流感病毒(H3N2)所致的“香港流感”在香港大规模暴发，据统计，美国共有3.4万人因感染致死。 1977年1月，“俄罗斯流感”(病毒类型H1N1)在前苏联出现并流行。 1997年，开始出现禽流感病毒(H5N1)，尽管该病毒很少感染人，但仍然夺去了18个人的生命，这些人大都与家禽有过直接接触。2009年4月，墨西哥、美国等多个国家和地区相继暴发甲型H1N1流感。2014年5月17日从广东省卫生计生委获悉，梅州和中山各新增一例人感染H7N9禽流感确诊病例。,.,大流行病毒,禽病毒,人病毒,禽重组病毒,禽病毒,在猪中重组,在人中重组,可能导致大流行的禽人重组病毒的产生,.,耐药淋病双球菌,2013-5-7 瑞典病原性淋病双球菌参考实验室的乌内莫与日本学者合作在京都采集的检体样本中发现H041。这种菌株是在日本一名性工作者咽喉首先发现，而它对ceftriaxone的抗药力，比迄今所知任何菌株高出4到8倍。把H041与其他淋病菌株放在一起培养，因此出现的基因重组更使这些菌株的抗药性增加多达500倍。,.,研究发现，H041对治疗淋病的最后防线头孢菌素抗生素具有极强的抗药性。科学家认为，现有各种淋病疗法，对新变种的H041淋病双球菌均无可奈何，可能迫使医学界以号称历来最强效的碳青霉烯类抗生素尝试治疗。乌内莫强调，这种药效果有待观察。,.,2011年6月，有2000多人感染，表现为出血性肠炎，500多人并发严重的溶血尿毒综合征，20余人死亡。近30年来，引起出血性肠炎的病原菌主要是大肠杆菌O157：H7，所以德国最初认为这场腹泻疫情仍是大肠杆菌O157：H7所致。导致这次欧洲腹泻疫情的祸首原来是另一型大肠杆菌O104H4。大肠杆菌O104H4是从哪里来的？,耐药大肠杆菌,.,.,致病菌引起的中毒,1994年美国沙门氏菌病暴发；1996年日本芽菜大肠杆菌使人们认识到了细菌O-157中毒的危害；2006年美国开始陆续发生一些菠菜引起的中毒，后来还发生西红柿中毒；2006年是大肠杆菌O-157；2010年美国又发生千人以上沙门氏菌感染；2011年德国大肠杆菌也波及了16个国家；2013年美国又发现了15个大肠杆菌O-121，导致27个人受到感染；2014年1月3日，美国报告由乳制品引起的斯坦利沙门氏病例；苏格兰2月6日有15个人感染了大肠杆菌O-157。,.,主要内容：,.,.,.,.,.,表型饰变：,表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为粘质沙雷氏菌25产深红色灵杆菌素，37不产色素，降到25恢复产色。,遗传型变异（基因变异、基因突变）：,遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 （自发突变频率通常为10-6-10-9）,.,.,Pseudomonas aeruginosa (green) Chromobacterium violaceum (purple) Bacillus atrophaeus (brown)Serratia marcescens (red) Vogesella indigofera (blue) Staphylococcus epidermidis (white) Micrococcus luteus (yellow) Kocuria rosea (pink) Bacillus subtilis (orange) Arthrobacter agilis (red) Rhodococcus rhodochrous (pink on normal agar, black when grown in the presence of tellurite) Dermacoccus nishomiyaensis (orange) Micrococcus varians (white),.,.,.,.,.,.,.,选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：,（1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到 正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,MTV HRV,HRV MTV,.,朊病毒的发现与思考,亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚未 发现该蛋白内含有核酸。,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质PrP c改变折叠状态为PrP sc所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。,.,人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等,羊搔痒症(scrapie),牛海绵状脑病(spongiform encephalopathy),.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,.,诱变剂和诱变处理,物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。,.,化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。,.,2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射行工作时，设备费用大，并要注意安全性。3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。,.,诱变剂的选择,1碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。2亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。,.,3吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。4紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。,.,二、诱变育种步骤,出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选,.,(一)出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4出发菌株开始时可以同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。,.,5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。 6根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。,.,(二)处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,.,(三)诱变处理,根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,.,(四)中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。,.,方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,.,(五)分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。,.,紫外线的诱变育种,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253.7nm灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,.,被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,.,亚硝基胍诱变曲霉菌,N甲基N-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。,.,.,.,.,.,Ames实验,.,“生物化学统一性”法则：,人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。,.,诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比,超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,.,回复突变(reverse mutation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。,美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验,具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率,.,Ames试验,.,证明Ames试验重要性的应用实例：,国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免,.,诱变剂与致癌物质Ames试验,由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。,.,1 菌种的衰退与复壮的概念(1).衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的原因：基因突变，分离现象。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,菌种的衰退、复壮及保藏,.,(2) 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。,.,(3)防止菌种衰退的方法： 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； 采用有效的菌种保藏方法。,.,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异；,b）污染；,c）死亡；,.,5.2、菌种保藏：(1) 目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种(2) 原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）,.,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,（参见P19）,菌种保藏基本要求：,基本方法：,生活态休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,.,1 冷冻保藏,冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。,.,冷冻保藏种类,一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80)三、液氮冷冻保藏技术,.,普通冷冻保藏技术(-20),将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。,.,应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。,.,二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80),要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。,.,如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。,.,三、液氮冷冻保藏技术,(一)冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。,.,(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，,.,安瓿瓶及封口,.,.,(2)从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。,.,2控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；,.,(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1/min，直到温度达-50；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)或 气相(-156)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。,.,(三)复苏 1从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解；3用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。,.,2.2 冻干保藏,冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。,.,培养物的冻干过程,.,冻干菌种的保藏与再生,1保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5下保藏。较低的保藏温度(-20-70)对于培养物的长期稳定更好。2复苏：(1)在超净工作台中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。(2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿,.,(3)在安瓿中加入0.51ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。(4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。,.,矿物油中浸没保藏,将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。,.,浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株23年也应做一次存活试验。,.,干燥保藏,微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。,.,沙土管法,取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10盐酸浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm，直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞121灭菌1h，也可用1702h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液(106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.30.5ml，用接种环将其混合均匀。,.,沙土管法,也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4下保存。从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。,.,沙土管法,在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种存活率的关系见图2-10。 用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。,.,沙土管法,.,滤纸保藏法,本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。其方法是3#滤纸剪成5mm50mm的小条，放入干燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。,.,大(小)米保藏法,是根据我国制曲原理加以改进的一种方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的菌直接培养在大(小)米培养基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。,.,甘油管保藏法,本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(1081010/ml)。取1ml灭菌甘油与1ml菌悬液充分混匀，使甘油浓度约为40%，于-20下冻存。,.,基因工程菌的保藏,由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。,.,当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。,.,微生物活力和稳定性测定,所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。,.,对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。,.,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 中国培养物保藏中心（CCTCC） 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 荷兰霉菌中心保藏所（CBS） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 日本大