定量RT-PCR原理.ppt

1、William P. Halford:,是否只有竞争性RT-PCR才能精确定量？,竞争性RT-PCR,PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性序列量的起始比例。 理想情况下，靶序列与参照物以相同的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开。,竞争性RT-PCR,参照物片段分两类: 同源性片段与靶序列只有微小差别 非同源性片段除两端引物模板区以外与靶序列不同,竞争性RT-PCR面临的问题,变异主要来源是样品RNA的纯度和完整性，应设内源性参照物。 若使用DNA参照物，反转录酶的效率未受控制。,RT-PCR定量的条件,确定PCR反应曲线上的有效范围，即在平台效应出现以前PCR扩增得到的终产物与加入的RNA数量

2、呈线性关系。 确定足够的样品数，保证可对PCR扩增产物量间差异进行统计分析。,非竞争性RT-PCR,目前主要采用荧光实时RT-PCR，放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。,实时RT-PCR,实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线。 根据PCR 变化曲线计算出目标靶基因分子数。,传统RT-PCR与实时RT-PCR的流程比较,荧光定量RT-PCR基本流程,荧光测定的光学原理图,Molecular Beacon Method,Dye Incorporation Method,Hybridisation P

3、robe Method,Taqman荧光定量PCR技术,特异性荧光 标记探针 Taq酶 53 外切酶活性,设置内参照,分为两种：在扩增反应中加入的外源参照物和样品中正常存在的内源参照物。 内源性参照物通常使用“管家” 序列或rRNA。,实时RT-PCR特点,扩增反应处于对数增长期，无平台效应。 无需处理PCR反应产物，减少污染。 检测范围更宽，速度更快。,Application,Quantification Mutation/Allele detection Multiplex RT-PCR Detection of mRNA splice variants,Mutation/Allele d

4、etection,Use different reporter dyes One increase homozygosity Two increase heterozygosity,Multiplex RT-PCR,Advantage: Time and reagent saving Limitation: availability of multiple reporters excitation and detection ability,多重定量PCR结果,TNF-, TGF-, TNF- and lymphotoxin- amplifications (FAM) in replicate

5、s of 5,18S ribosomal RNA endogenous control amplifications (VIC) showing all 20 sample wells,Detection of mRNA splice variants,主要内容,1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用,退火，开始延伸,5,3,5,5,3,5,Forward Primer,Reverse Primer,TaqMan Probe,R,Q,替换,5,3,5,5,3,5,Forward Primer,Reverse Primer,R

6、,Q,剪切,5,3,5,5,3,5,Q,R,延伸结束,5,3,5,5,3,5,R,Q,荧光定量PCR实验荧光强度的计算公式,Rn=总荧光强度 RB=基本（空白）荧光强度 XO=靶基因起始拷贝数 EX=扩增效率（0 EX 1） n =扩增循环数 RS=每个荧光分子的荧光强度,达到阈值时的计算公式,RB, Rs 和 Ex 是确定的 Rn=RT=阈值 n=CT= 达到阈值时的循环数,CT的推导过程,RT =RB+XO(1+Ex)CTRs log(RT -RB)=log XO +CTlog(1+ Ex)+logRs CTlog(1+ Ex)=log(RT -RB)-log XO -logRs,CT =

7、 -k logX0 + b,Ct,起始DNA拷贝数,CT值与起始DNA拷贝数的关系,Rn (荧光信号),Cycle Number（循环数）,Threshold（阈值）,CT,阈值的作用：确定CT值,阈值 = 基线（背景）信号均值基线（背景）信号标准偏差 x 10 基线的范围： 从第3个循环起到指数增长开始前3个循环止。 一般取3-15循环。,确定阈值的标准：基线,基线,阈值,标准偏差,3个循环,阈值选择的推导原理,1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的 2. 偶然误差的结果满足对数分布 3. 阈值 = 基线（背景）信号均值基线（背景）信号标准偏差 x 10 4. 由于测量的偶然

8、误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于105 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光信号强度可以测量得到,Sample,No Template,Threshold,Baseline,Rn+,Rn-,Rn,Ct,PCR 反应曲线,未知样品 标准品：产生标准曲线 内参比（Internal Standard）ROX 校正样品管和加样误差 内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差 +/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求,定量准确的要素,多色荧光技术,准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小

9、 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力： FAM：标记目的基因探针 VIC：标记第二个目的基因或IPC探针 TAMRA：淬灭基团 ROX： 内参比荧光,使用ROX内参比的效果,使用 ROX,不使用 ROX,Beta actin TaqMan定量,使用ROX内参比的好处,提高荧光定量的定量精度，减少孔间差异,报告荧光,参比荧光,样品管1,样品管2,不使用参比荧光 校正的结果,使用参比荧光 校正的结果,ROX荧光内参比的作用,以固定浓度存在于TaqMan PCR缓冲液中，常用ROX 荧光强度均一化(Normalize)： Rn = RReporter / RROX

10、， Rn = Rn,sample Rn,blank 影响荧光信号强度的因素包括： 光纤出口处的激光强度；管盖厚度、透光性 缓冲液和反应体积等 校正管间差异，保证实验结果的重现性,5 Nuclease Multiplex Assay,FAM dye labeled 35S Target,VIC dye labeled ER,阳性内对照(IPC),为操作方便，取样一般以克或uL为单位 IPC一般选用基因组中单拷贝的管家基因，其定量结果代表了基因组的数量，也就是检材中细胞的数量。 CT = CT Sample - CT IPC将定量结果校正为以基因组为单位，不同样品之间具可比性。,阳性内对照(IPC

11、),IPC除了用于计算CT，校正定量结果外，还可以起到阳性对照的作用，用于判断阴性结果的真伪。 真阴性检材-；IPC+ 假阴性检材-；IPC- 常用的内对照： 18S rRNA -actin GAPDH,标准品的选择,标准品可以从ABI购买，也可以自己制备 标准品的单位并不重要，取决于对最终结果的要求：拷贝数，%，ng/uL, mol/uL 如转基因定量的国际标准是%(w/w) ，标准品最好是先将不同重量比的转基因与非转基因食品粉末混合，然后抽提DNA；不要先抽好DNA，再用水梯度稀释 如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度稀释已知摩尔浓度的DNA,目的基因 CtFAM = 40,IPC (VIC layer) 基因 CtVIC =