地方标准编制说明-农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程

1、农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程编制说明一、工作简况根据国家糖料产业技术体系任务要求及内蒙古自治区市场监管局关于下达2019年第2批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知（内市监标准字2019300号）文件精神，由内蒙古自治区农牧业科学院提出并负责农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程地方标准的起草工作。主要起草人：张自强，白晨，李晓东，张惠忠，王良，韩平安，张必周，付增娟，赵尚敏，鄂圆圆，郑文哲，张辉。二、制定本标准的必要性和意义甜菜是世界上重要的糖料作物之一，也是我国第二大糖料作物。然而，甜菜播种、收获季节性强，人工作业存在劳动强度高、效率低、收获损失大和占用农时多等问题，这些问题制约了甜菜产业进

2、一步发展。实现甜菜生产机械化，使甜菜生产从分散型向集约型转变，不仅有利于提高生产率、节约劳力和降低劳动强度，也是甜菜产业发展的必然出路。随着甜菜机械化作业程度的不断提高，特别是大规模集约化生产的不断推进，甜菜生产中病虫草害越来越重，特别是草害的防控，通过育种和人工除草不能完全解决问题，只能通过化学除草，然而甜菜对除草剂又是特别敏感的作物，故而甜菜的草害已经严重制约了我国甜菜产业的发展。通过本标准建立农杆菌介导转化甜菜的技术，培育出抗除草剂（草甘膦）的甜菜品种，将使得灭生性除草剂可以在甜菜地里应用，有效的解决甜菜生产机械化作业后的除草问题，方便进行田间管理，极大的解放劳动力，降低甜菜种植成本，对

3、于提高甜菜产量和品质，增加农民收入，促进我国甜菜产业的发展具有重要的现实意义和广阔的应用前景。三、本标准的起草过程近年来，我们在国家现代农业产业技术体系和内蒙古自治区科技重大专项“甜菜生物技术育种体系研究与应用”项目的专项资金支持下，由内蒙古自治区农牧业科学院特色作物研究所开展农杆菌介导转化甜菜的试验，经过多年大量的试验，内蒙古自治区农牧业科学院特色作物研究所对试验结果进行了集成与组装，编制形成了“规程”草案。四、本标准主要技术指标确定的依据主要技术指标来源于20082018年在内蒙古自治区农科院进行的农杆菌侵染液的制备试验、甜菜无菌苗叶片-叶柄预培养试验以及农杆菌侵染甜菜叶片-叶柄试验等试验

4、结果。五、主要条款的说明本标准的主要内容包括以下四项：（1）侵染液的制备：将培养好的农杆菌刮下来，放置侵染液培养基中重新悬浮，使其OD600值在0.300.50之间，然后冰浴1 h，备用。（2）外植体的准备：外植体叶片-叶柄放进行预培养环境：温度23 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。预培养时间2 d6 d。预培养后的叶片-叶柄，沿其茎走向用手术刀划出伤口，伤口的深度以不切透叶片-叶柄为准。（3）农杆菌侵染方法：处理后的叶片-叶柄放入侵染液中，使用真空泵抽真空，使叶片-叶柄完全浸入侵染液，侵染20 min30 min。（4）侵染后外植体培养条件：共培养的培养环境：温度23 ，暗培养

5、，培养时间3 d6 d；脱菌培养的培养环境：摇床转速125 rpm，温度25 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h，培养2 d3 d；筛选培养的培养环境：培养条件：温度25 ，光照强度3000 Lux，光照时间14 h。六、重大意见分歧的处理依据和结果无。七、采用国际标准和国外先进标准的，说明采标程度，以及国内外同类标准水平的对比情况无。八、其他应说明的事项无。九、标准草稿征求意见情况汇总表序号意 见提出单位/专家采纳不采纳（说明原因）1各个激素首次出现应该给出中文名称，如NAA（萘乙酸），因为后面4.4-4.9激素均用的中文名称。内蒙古农业大学/史树德采纳2pH=5.8，改为pH=5

6、.8，内蒙古农业大学/史树德采纳3农杆菌感受态类型、拉丁文应标出内蒙古农业大学/史树德采纳4改为：将生长过夜的农杆菌刮下，放置侵染液培养基中混匀放在摇床上，温度 28 ，转速 75 rpm100 rpm，摇 2 h4 h，使其OD600值在0.300.50之间，备用。内蒙古农业大学/史树德采纳5抽出容器中空气，制造真空环境，改为：使用真空泵抽真空，使叶片-叶柄完全浸入侵染液。内蒙古农业大学/史树德采纳6改为：从侵染液中取出叶片-叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放入共培养培养基中，.内蒙古农业大学/史树德采纳7改为：脱菌 2 d3 d后，因上面8.4是培养 2 d3 d。内蒙古农业大学

7、/史树德采纳8使用浓度为 1.2 ml/L的草甘膦溶液，该浓度是大田除草时使用浓度？说明一下较好内蒙古农业大学/史树德采纳9该标准提出了遗传转化所需的一系列培养基制备、种球的的消毒技术及无菌苗的培养过程、外植体的制备、农杆菌的制备、侵染及遗传转化过程、再生苗的筛选和目的基因的检测等过程。该标准即体现了农杆菌介导的植物遗传转化的共性，也反映了甜菜遗传转化的特殊性。该标准的建立为抗除草剂甜菜的培育和有效的解决甜菜生产机械化作业后的除草问题提供了基础。不足之处：该标准里没有体现转化率。内蒙古农牧业科学院/斯钦巴特尔采纳10建议该部分改为“4 培养基配制”内蒙古农牧业科学院/郭晓霞采纳11该部分中灭菌

8、水与无菌水是否为同一物质，若为同一物质，建议全文统一，若为不同物质，在5.1 灭菌前准备进行交代。内蒙古农牧业科学院/郭晓霞采纳12该部分“1 M，pH=5.8，”多一个逗号，建议全文检查。内蒙古农牧业科学院/郭晓霞采纳13种球萌发过程的培养环境是否也对光照强度、时间等有要求，若有需交代，或者与接种到新的培养基中的培养环境是否一致，如果一致可统一交代，若不同，上下表述的格式应一致。内蒙古农牧业科学院/郭晓霞采纳14该两条内容中表述为“培养条件”5.3中则表述为“培养环境”，建议全文统一。内蒙古农牧业科学院/郭晓霞采纳15该条中表述为“培养过夜”，建议对培养时间进行准确表述。内蒙古农牧业科学院/郭晓霞采纳16该3条中表述为“培养2 d-3 d”、“大约15 d”、“20 d左右即可诱导出新生根”，标准中其余类似表述均为“培养时间为”,建议全文检查，