挥发性盐基氮

1、.,第三章 原料鱼和肉的鲜度检验,.,挥发性盐基氮的测定,挥发性盐基氮(TVBN):指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质呈碱性，具有挥发性，称为总的挥发性盐基氮。 淡水鱼主要是氨，海水鱼是氨和低级胺。 挥发性盐基氮作为鲜度作为限度的指标研究很多，资料证明挥发性盐基氮的增加和鲜度感观检验结果符合，因此被全世界所认可。 中华人民共和国国家标准 农产品安全质量 无公害水产品安全要求,.,鲜度要求,.,我国几种鱼贝类的VBN值,.,分解蛋白质的酶,分解蛋白质而使食品变质的微生物，主要是细菌、霉菌和酵母菌，它们多数是通过分泌胞外蛋白酶来完成的

2、。 细菌:芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、假单孢菌属、变形杆菌属、链球菌属等.分解蛋白质能力较强，即使无糖存在，它们在以蛋白质为主要成分的食品上生长良好； 肉毒梭状芽孢杆菌分解蛋白质能力很微弱，但该菌为厌氧菌，可引起罐头的腐败变质 霉菌:都具有分解蛋白质的能力，霉菌比细菌更能利用天然蛋白质。常见的有：青霉属、毛霉属、曲霉属、木霉属、根霉属等。 酵母菌:多数酵母菌对蛋白质的分解能力极弱。,.,氧化脱氨基作用,还原脱氨基作用,水解脱氨基作用,脱羧基作用,挥发性盐基氮的产生机理,.,一般海水鱼在25-30mg/100g以下人为新鲜。 软骨鱼类（如鲨鱼）由于肌肉中含有尿素以平衡体内外的渗透压，因此新鲜的软

3、骨鱼肉TVBN很高，不在这个范围。,.,半微量蒸馏法,.,半微量蒸馏法,一、原理： 挥发:挥发性含氮物质加热可在碱性溶液中释放出 吸收：挥发后吸收于硼酸吸收液中 2NH3 + 4H3BO3(NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：生成的硼酸铵用标准酸滴定，计算含量。 (NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2 NH4Cl + 4H3BO4 反应物质量对应关系： NH3HCl,.,二、试剂,1. 氧化镁混悬液（1%）：称取决1.0g 氧化镁，加100mL水，振摇成混悬液。 2. 40%氢氧化钠：称取40gNaOH溶于水中，定容至100mL。 3. 2%硼酸：称取2g硼酸用水溶解并定容至

4、100mL。 4.盐酸C(HCl)=0.01mol/L或硫酸C(1/2H2SO4)=0.01 mol/L的标准滴定溶液。 5. 混合指示剂: 0.1%甲基红乙醇液：称取0.1g甲基红溶于100mL 60%乙醇中。 0.2%次甲基蓝指示剂：称取0.1g次甲基蓝溶于100mL 水中。 甲基红指示剂（0.1）,次甲基蓝指示剂（0.2）,临时用将上述两种指示液等量混合为混合指示液。变色范围：5.2-5.6，由红紫色变为绿色，变色点5.4，颜色为暗蓝色。,半微量蒸馏法,.,三、仪器,半微量凯氏定氮装置; 微量滴定管：最小分度0.01mL。,半微量蒸馏法,.,四、分析步骤,1. 样品处理：将样品除去脂肪、

5、骨及腱后，切碎搅匀。称取约10.00g, 于锥形瓶中，加100mL水，不时振摇，浸渍。30min 后过滤，取滤液置冰箱备用。,半微量蒸馏法,.,2. 蒸馏：向接收瓶内加入2%硼酸10mL 及2滴混合指示剂，并使冷凝管下端插入液面下。 蒸馏水中加入甲基橙指示剂数滴，再加入稀硫酸，使溶液保持橙红色。 吸取10.0mL样品液注入凯氏定氮仪的反应室中，用10mL蒸馏水冲洗进样入口，再加5mL氧化镁悬液(1) 。塞好入口玻璃塞，用少量蒸馏水冲洗进样入口，且在入口处加水封好，防止漏气。,半微量蒸馏法,.,打开水蒸汽发生器与反应室之间的夹子，蒸汽通入反应室，徐徐蒸馏，使氨气被蒸发出来，并通过冷凝管而进入接收

6、瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏5min，停止蒸馏。 结束：取下接收瓶，松开水蒸汽发生器瓶上的夹子，迅速夹紧水蒸汽发生器和反应室之间的夹子，将废液排出。用蒸馏水将冷凝管和接收管洗涤，合并入吸收液。,半微量蒸馏法,.,3.滴定:微量酸式滴定管盛盐酸标准滴定溶液（0.01mol/L）或硫酸标准滴定液，吸收液用标准酸滴定，边滴定边振荡，直到溶液由绿色变为蓝紫色，同时做试剂空白试验。,.,五、计算,样品中挥发性盐基氮的含量mg/100g = (V1V2)C114 / (m110/100) 100 V1：测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，ml； V2：试剂空白消耗盐酸或硫酸标准液体积，ml； C

7、1：盐酸或硫酸标准溶液的实际浓度，mo/Ll； 14：与1.00mL盐酸标准滴定溶液C(HCl)= 1.000 mol/L 或硫酸标准滴定溶液C(1/H2SO4)=1.000mol/L 相当的氮的质量，mg ； m1：样品质量，g； 允许差：相对偏差10%,半微量蒸馏法,.,六、实验注意事项,1蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸。 2.加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。 3.蒸馏水应保持酸性，防止水中的游离氨被蒸出而使结果偏高。 4.蒸馏是否完全，可用精密pH试纸测试冷凝管出口的冷凝液是否呈碱性来确定。,半微量蒸馏法,.,微量扩散

8、法,.,微量扩散法,一、原理： 挥发:挥发性含氮物质在37可在碱性溶液中释放出 吸收：挥发后吸收于硼酸吸收液中 2NH3 + 4H3BO3(NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：生成的硼酸铵用标准酸滴定，计算含量。 (NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2 NH4Cl + 4H3BO4 反应物质量对应关系： NH3HCl,.,二、仪器,康威氏微量扩散皿（标准型）：玻璃质，内外室总直径61mm，内室直径35mm，外室深度10mm，内室深度5mm，外室壁厚3mm，内室壁厚度2.5mm，加磨砂厚玻璃盖。 微量滴定管：最小分度0.01mL,微量扩散法,外室,内室,.,三、试剂,饱和碳酸钾

9、溶液：称取50g碳酸钾，加50mL水，微加热助溶，使用上清液。 水溶性胶：称取10g阿拉伯胶，加10ml水，再加5ml 甘油及5g 无水碳酸钾(或无水碳酸钠)，研匀。 硼酸吸收液 (2)。 盐酸C(HCl)=0.01mol/L或硫酸C(1/2H2SO4)=0.01 mol/L的标准滴定溶液。 混合指示剂: 0.1%甲基红乙醇液：称取0.1g甲基红溶于100mL 60%乙醇中。 0.2%次甲基蓝指示剂：称取0.1g次甲基蓝溶于100mL 水中。 甲基红指示剂（0.1）,次甲基蓝指示剂（0.2）,临时用将上述两种指示液等量混合为混合指示液。,微量扩散法,.,四、分析步骤,样品处理： 取10.0克肉

10、，在研钵中研碎，加入50mL水，移至烧杯中，充分搅拌，浸提30min。 然后加入20过氯酸10mL，沉淀蛋白质，充分搅拌，过滤。或三氯乙酸 用碱中和至pH7，收集滤液于100mL容量瓶中，定容。 2. 加样: 将水溶性胶涂于扩散皿的边缘，在皿中央内室加入1mL硼酸吸收液及1滴混合指示液，溶液呈红紫色。 在皿外室一侧加入1mL的样液，另一侧加入1mL饱和碳酸钾溶液，注意勿使两液接触，立即盖好.,微量扩散法,1mL饱和碳酸钾,1mL样液,.,3. 反应: 用毛玻璃密封后，将皿于桌面上轻轻转动，使样液与碳酸钾溶液混合，然后于37温箱内放置2h。溶液呈绿色。 4. 滴定： 揭去盖，用盐酸或硫酸标准滴定

11、液(0.100mol/L)滴定内室的吸收液，终点至蓝紫色， 同时做试剂空白试验。,微量扩散法,.,四、计算,挥发性盐基氮的含量mg/100g =(V1-V2)C114 /( m11/100)100 V1：测定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，ml； V2：试剂空白消耗盐酸或硫酸标准液体积，ml； C1：盐酸或硫酸标准溶液的实际浓度，mo/Ll； 14：与1.00mL盐酸标准滴定溶液c(HCl)=1.000mol/L或硫酸标准滴定溶液c(1/H2SO4)=1.000mol/L 相当的氮的质量，mg ； m1：样品质量，g； 允许差：相对偏差 10%,微量扩散法,.,二、K 值,鱼类的肌肉运动必须依靠三磷酸腺苷(ATP)转化提供能量， 而鱼体死后其体内所含ATP按下列途径分解: ATPADP(二磷酸腺苷) AMP(一磷酸腺苷) IMP(肌苷酸) HxR