K5-3DNA和蛋白质技术

1、专题5 DNA和蛋白质技术,血红蛋白的提取和分离,课题3,一、基础知识：,（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖。也叫分子筛）,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。,2、凝胶色谱法,当不同的蛋白质通过凝胶时，相对相对分 子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道， 路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较 大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,3、原理：,4、具体过程：,（二） 缓冲溶液：,抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定,1、原理：,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组

2、成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等）,2、配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液,3、作用：,在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,1、原理：,不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同， 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同， 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电； 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决

3、于分子大小。,(三)电泳：,指带电粒子在电场作用下发 生迁移的过程。,2、分离方法：,3、分离过程：,二、实验操作实验步骤,血液组成成分,阅读思考： 血液由_和_两部分组成。 血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。 该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐 磷脂 葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白,两个a肽链,两个一肽链,血液组成成分:,（一）样品处理及粗分离,1、红细胞的洗涤,除去血浆蛋白等杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清

4、液没有黄色,2、血红蛋白的释放,在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。,目的： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,3、分离血红蛋白,分离过程,红细胞 混合液,4、透析（粗分离）除去分子较小的杂质,在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸缓冲液中。,pH7的磷酸缓冲液维持血红蛋白的正常特性。 缓冲液量远多于血红蛋白溶液量有利于杂质分 子充分地向外扩散。,（二）纯化,1、凝胶色谱柱的制作：,2、凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3、样品的加入和洗脱,-凝胶色谱操作,材料：

5、交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填:,2、凝胶色谱柱的装填,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,3、样品的加入和洗脱,基本过程： 调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面 洗脱收集分装蛋白质,缓冲液,样品,注意：正确的加样操作,1、不要触及破坏凝胶面,2、贴壁加样,3、使吸管管口沿管壁环绕移动,（四）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 凝胶的预处理： 沸水