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文档简介
1、基因工程实验,生物化学资料网,实验目录,实验一 实验计划表 实验二 染色体DNA的提取 实验三 PCR扩增 实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接 实验五 感受态细胞的制备 实验六 重组质粒的转化 实验七 质粒的提取 实验八 重组质粒的酶切鉴定,实验一 实验计划表,一、实验目的,、了解本学期整体的实验流程及安排。 、熟练使用微量移液器。 、学习制备琼脂糖凝胶。,生物化学资料网,基因工程(Gene Engineering)又称重组技术,把不同生物的与载体相连,并导入到受体细胞中去增殖、表达。 基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。,二、实验原理,生物化学资料网,凝胶电泳系统、微量移液器、
2、三角瓶、微波炉、铲子、手套 琼脂糖、1TBE、加样缓冲液,三、实验用具及试剂, 目的基因的获取 基因组总提取凝胶电泳检测 扩增目的基因 产物的电泳检测 产物纯化获得目的基因,四、实验操作,1.本学期实验计划,生物化学资料网,重组、转化 与pMD18-T连接DH5a感受态细胞制备 转化、平板涂布、培养 筛选与鉴定 抗生素抗性筛选挑单菌落培养提取质粒质粒酶切、电泳检测,2.微量移液器的使用,将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器,使吸头浸入页面下几毫米,千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮,吸上样品液。否则液体进入吸头太快,导致液体倒吸入移液枪内部,或吸入体积减少。
3、等1s后将吸头提高液面,并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点,在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器,使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头,使用操作,生物化学资料网,使用注意事项,未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 一定要再允许范围内设定容量,千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围,否则会造成损坏。 不要横放带有残留液体吸头的移液器 不要用大量程的移液器移取小体积样品 微量移液器每日用完后,应旋转到最大刻度,让弹簧恢复原形,保持弹性。 为了确保微量移液器的准确性,移液器必须定期进行校准。,生物化学资料网,3. 琼脂糖凝胶制作,选择好胶盒、胶板和梳子,
4、洗净,把胶板放入胶盒中,梳子插上。 量取25ml 1TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中 称量0.25g 琼脂糖,倒入锥形瓶中 将锥形瓶放入微波炉中,让溶液沸腾2-3次,琼脂糖彻底融化 锥形瓶取出,稍稍冷却后倒入胶盒中 等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可,掌握酚氯仿法提取的原理和操作。,一、实验目的,实验二基因组总提取,生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合,蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程,因此需把蛋白质除去,一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用,而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后,蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界
5、面,DNA则留在水相,少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响,必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。,二、实验原理,消化缓冲液: TE 、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶K Tris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1),NaAc,无水乙醇,70%乙醇,三、实验用具与试剂,微量移液器、高速离心机、1.5ml管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱,、切取组织 ,剪碎放入研钵(越细越好),磨成粉末。以消化缓冲液处理55水浴过夜,获得组织消化液。 、取出消化组织液,5000rpm,min,取上清液于新离心管 。 、 加等体积
6、ris-平衡酚,轻轻混匀min。 4、1000rpm,10min,留上清,取上清液于新离心管 。 、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,轻轻混匀min。 、同。 、加等体积氯仿:异戊醇,轻轻混匀min。 、同。,四、实验步骤,、加1/10体积3mol/LNaAc,及.倍体积预冷()无水乙醇,混匀。 沉淀min。 、12000rpm,15min,弃上清。 、加70%乙醇1ml,混匀。 、 同。 、管放置于烘箱中烘干。 、加ul TE或ddH2O溶解。 、琼脂糖凝胶电泳检测。,提取染色体的基本原理是什么?操作中应该注意什么?,五、思考题,、学习扩增的基本原理。 、掌握技术的常规操作。
7、、了解扩增的参数设计。,一、实验目的,实验三扩增,、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction,PCR):利用核酸变、复性的性质,以待扩增的为模板,在体外由引物介导的酶促合成特异片段的过程。 、反应体系 引物、dNTP、 Mg 、模板、 Taq DNA聚合酶, Buffer。,二、实验原理,、循环参数 9 5min 9 30s 5 30s 72 30s goto times 72 10min,Taq DNA聚合酶,PCR缓冲液, MgCl2,dNTP,引物,模板,ddH2O,TBE电泳缓冲液,EB,加样缓冲液,三、实验用具与试剂,旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,
8、0.2ml PCR微量离心管,PCR仪,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,紫外凝胶成像系统,、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 dd water 20.5ul 10PCR buffer(不含MgCl2) 3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L Primer 1 1ul 10mol/L primer 2 1ul 模板 1ul Taq酶 0.5ul 总体积 30ul,四、实验步骤,、在离心机中混匀。 、管放入仪中,按照原理中的条件设置程序,进行反应。 、PCR结束后,取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。,五、思考题,P
9、CR中产生非特异性条带的原因可能有哪些?,实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接,一、实验目的,1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。 2. 掌握DNA体外连接的方法。,二、实验原理,DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关 DNA分子大小 DNA分子构象 琼脂糖凝胶浓度 电泳所用电压 电泳缓冲液,生物化学资料网,2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA,而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。 3. Taq酶参与PCR反应中,产物双链核酸中的3端各多连接一个脱氧腺苷酸A,与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下,按照碱基配对形成环状的完整
10、质粒。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,凝胶电泳系统,刀片,紫外仪,酒精灯 1.5ml EP管,1.5ml EP管架,65 水浴锅 PCR产物,1TBE,加样缓冲液,TakaRa胶回收试剂盒,TA克隆试剂盒,DL2000 marker,生物化学资料网,1. 2%琼脂糖凝胶电泳 2. 在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量 3. 加入5个凝胶体积量的DR- Buffer 4. 混匀 65加热融化凝胶块 5. 加入DR-Buffer量的1/2 体积的DR- Buffer, 当目的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇 6.
11、将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm, 1min 弃滤液 7. 加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液 8. 加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液 9. 同8,四、实验步骤,10. 将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测 11. 链接反应(冰上操作) 在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂: 纯化的目的DNA片段 4.5ul Vector 0.
12、5ul 连接液 5ul 混匀 16连接过夜,五、思考题,为什么连接反应的温度要定在16度?,生物化学资料网,实验五 感受态细胞的制备,掌握感受态细胞的制备方法 2. 学习和理解影响细胞感受态的因素,一、实验目的,生物化学资料网,感受态是指受体(或者宿主)细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是有受体菌的遗传性所决定的。转化过程中所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,既不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。用Cacl2处理受体细胞,使细胞的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。,二、 实验原理,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,培养皿,离心
13、管,冷冻高速离心机,超低温冰箱,摇床,锥形瓶 Cacl2, LB Amp-液体培养基, LB Amp-固体培养基,DH5甘油菌,1.先从保存菌种DH52(-70),划线培16h(37) 2.从平板中挑取一个单菌落移到4ml,LB Amp- 培养基中,37摇荡过夜180250rpm 3.按1%的接种量将过夜培养的菌转接于50ml LB Amp-的培养基中,37,250rpm(2h2.5h) 4.当培养菌生长至OD600达0.50.6时(约22.5h),将培养菌取出,在无菌条件下将细菌转移至50ml无菌聚乙烯离心管中,冰浴10min,以使培养液冷至0,四、实验步骤,5.4,5000rpm/min,
14、7min 6.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬于4,5000rpm/min,5min 7.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬冰上放置30min, 于4,5000rpm/min,5min 8.用2ml冰冷Cacl2溶液重悬各管细胞,然后按每管100ul的量分装于预冷的0.5ml EP管中存于-70,生物化学资料网,五、思考题,如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落,你将如何解释这种想象?,生物化学资料网,实验六 重组质粒的转化,一、实验目的,掌握重组质粒的转化方法,生物化学资料网,二、实验原理,1.转化是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。
15、 2.化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞,然后通过热休克处理,即置于42高温热激90s,热休克后,是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上,使其表达足够蛋白质,以便能在含抗生素的平板上生长菌落。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,水浴锅,培养箱,枪头,冰盒,超净台,微量加样器,制冰机,牙签 DH5感受态细胞,连接产物,LB Amp-液体培养基, LB Amp+液体培养基,LB Amp+ 培养基平板,1.5ul连接液加100ul感受态细胞(-70取出),置冰上,加后轻轻旋动 2.冰上静置30min 3.42水浴90s热休克,冰上3min 4.加10ul LB (Amp-)至菌
16、液,混匀(颠倒) 5.37烘箱30min 6.37,摇床 30min 180rpm 7.涂平板 100ul/板, 37培养1216h 8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Amp+液体培养基中,37 振荡过夜,四、实验步骤,生物化学资料网,五、思考题,当质粒加入宿主细胞进行转化,再涂布在含有Amp的LB培养基平板前,为什么要在LB培养基中培养1h?,生物化学资料网,实验七 质粒的提取,1.学习质粒DNA提取的基本原理 2.掌握质粒最常用提取方法,一、实验目的,生物化学资料网,二、实验原理,细菌质粒DNA的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量较小、易于复性的特点进行的,碱法是常用的提取方
17、法。在热或碱性条件下DNA分子双链解开,若此时将溶液置于复性条件,由于变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性,从而分离质粒DNA。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,高速离心机、微量移液器、枪头、凝胶电泳系统,凝胶紫外成像系统,EP管 EB,加样缓冲液,阳性克隆的培养液,质粒提取试剂盒,生物化学资料网,四、实验操作,1. 取14ml过夜培养的阳性克隆菌液,12000rpm离心2min,弃上清 2.用250ul的solution(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀 3.加入250ul的solution轻轻上下翻转混合56次使菌体充分裂解,形成透明溶液 4.加入400ul的4
18、预冷的solution,轻轻上下翻转混合56次,直至形成紧实凝集块,室温静置2min,生物化学资料网,5.室温12000rpm, 10min,取上清 6.将试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上 7.将操作6中的上清液转移至Spin column中12000rpm, 1min,弃滤液 8.将500ul的RinseA加入Spin column中, 12000rpm,30s,弃滤液 9.加700ul的RinseB加入Spin column中, 12000rpm,30s,弃滤液 10.同9,生物化学资料网,11.将Spin column安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜中央处加入60ul灭菌或Elution Buffer,室温静置1min 12. 12000rpm, 1min洗脱DNA 13.凝胶电泳检测提取效果,并以空载体做对照,从质粒大小上初步判断是否有外源基因进入载体,生物化学资料网,五、思考题,在碱法提取质粒DNA操作过程中应该注意哪些问题?,生物化学资料网,实验八 重组质粒的酶切鉴定,1.学习和掌握限制性内切酶的特性 2.了解重组质粒的鉴定方法
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