生物芯片的研究与开发

1、生物芯片的研究与开发1. 分子印章法 DNA芯片原位合成技术 :结合组合化学合成与软光刻微印刷技术的原理，采用成熟的寡核苷酸固相合成工艺，在预先制作的弹性印章上实现空间寻址的核酸原位合成：将不同的寡核苷酸（或多肽）合成试剂涂抹在凹凸不平的印章表面并将其压印到基片特定位点进而进行偶联固定。开发出高密度基因芯片设计软件，并成功制备位点尺寸为 30微米的高宽比（大于 25）分子印章；建立了一套用于高密度基因芯片制备装置， 并成功将软光刻原位合成应用到 DNA芯片和肽核酸芯片的制备中。合2成偶联效率大于97%，25个碱基的寡核苷酸正确率大于 70%。制备出 65536/cm阵列的寡核酸芯片，杂交结果表

2、明该芯片能够有效区分单碱基错配序列。获得美国专利项，中国专利 2 项，并有 5 项中国专利处于二审中。在 Laingmur，中国科学等杂志上发表论文 16篇。该技术已通过江苏省科学技术厅鉴定。如能建立分子印章法批量化生产的寡核苷酸微阵列芯片的原位合成试生产线，制备出高质量、标准化、低成本的寡核苷酸微阵列芯片来检测与分析基因表达谱、图 1 基于软光刻技术的高密度基因芯片制备装置。自行研制的用于高密度基因芯片制备的实验装置（左图） ；表面亲水处理的 PDMS分子印章的电镜照片和全貌图（右图）基因突变体、免疫反应、受体结合、蛋白质结合、药物分子等非核酸类的分子识别 / 结合领域， 其应用将遍及生物、

3、 医学的各领域， 如基因组研究、 SNP检测、STR检测、肿瘤研究、药理学研究、药物靶标研究、药物毒性研究、病原体研究、医学诊断、病理学组织研究、微生物与发酵研究等该芯片技术获得了中国发明专利和美国专利，并被Nature Biotechnology推荐。2. 管盖基因芯片及其检测系统 ：管盖基因芯片是将基因探针固定在特制的管盖内表面，与内置杂交贮液池的Eppendorf 管一起构建的基因检测器件。在一个全封闭的管内，完成基因扩增，1 / 7荧光标记，芯片杂交及检等一系列生物化学操作，实现多基因高通量并行检测。用于管盖基因芯片的检测分析系统， 它包括光学检测平台、 图像采集系统、 图像分析系统及

4、结果报告系统。 光学检测平台利用尼康显微镜光学系统， 通过电荷耦合器件 (CCD)的进行图像采集。 管盖基因芯片杂交后， 经过荧光信号被 CCD捕获，经通用串行总线（ USB）传递给计算机。图像经过旋转、去噪声点、图像分色、图 2. 左图及中图为管盖芯片实物，右图为用荧光显微镜检测的针对多种呼吸道病毒检测的杂交结果。杂交信号判定、有效性判定及结果输出。我们运用该系统，对于呼吸道十种病毒进行同时检测。实验结果表明，该系统能够准确检测病毒的杂交信号并给出检测结果。基于管盖型基因芯片的呼吸道病毒检测芯片成功地检测了国家生物制品检定所提供的SARS标准品，并在华大基因中心检测了30 多个SARS样本，

5、取得了满意的结果。 该成果已通过了江苏省科技厅组织的科研成果鉴定。图 3 管盖芯片检测仪3. 病毒及微生物收集器及一体化检测仪 ：病毒及微生物收集器是能够对空气中的微量化学物质和病原体（包括病毒）2 / 7进行高效、快速富集和浓缩的新装置。 利用病毒颗粒在粘性表面的黏附作用和容易洗脱的特点，基于鼻腔结构和鼻黏膜机理的气体吸附腔 , 通过抽气泵，将空气中的病毒颗粒吸入吸附腔，粘附在黏膜表面，然后用蠕动泵将洗脱液注入腔内，通过超声震荡器， 将黏膜和病毒等一起洗脱， 储于 2ml 的标准冻存管中。 收集管中的洗脱液可收集并集中检测。 洗脱液中加入了病毒灭活剂， 保证仪器的安全使用。该装置的采气速率为

6、 3 升/ 分。采气时间为 1、10 或 30 分钟。病毒收集在小于0.5ml 的溶液中。通过分散在空气中的灭活甲肝病毒和标记蛋白粉末试验，病毒颗粒的收集效率在 90%以上。经检索，在国际上尚没有有效收集和检测病毒的装置。基于该成果的国内发明专利已批准， 并已申报美国专利。 目前，该仪器把收集和毛细管检测相集成， 开发出可以对各种场所里空气中微小物质进行收集、 浓缩并可进行 有针 对性 的实时 检 测 。 该 系统已获 2004 年 国家重 点新产品编号2004ED105009。病毒和微生物收集检测器， 可用于空气传播的病原学研究、 空气消毒剂效果研究、 疫点空气消毒效果评价、 流行期疫点空气

7、监测和环境中微生物污染的监测， 对控制疾病的流行具有重要意义 . 适用于大专院校、 研究机构、医院、疾病预防和控制中心及环境监测单位， 以及人口密集的地方空气中病原体以及其它生物物质的检测，防止生物恐怖等领域，具有较大的应用市场。3 / 74. 基于抗体微阵列的细胞免疫芯片及其一体化检测仪：该技术通过把细胞表面抗体制备成微阵列芯片，利用细胞表面所含有的抗原和对应的抗体之间的特异性反应， 捕获相关的细胞，检测细胞表面的抗原组合 35。该芯片可以高通量检测组织、 体液中特定细胞的表面抗原谱的特点。 我们研制的细胞免疫芯片一体化检测仪， 由恒温孵育部分、 清洗部分和检测部分组成， 可以将样本与芯片的

8、孵育、清洗、检测、结果输出等自动完成，提高检测结果的准确率。该检测仪可以用于进行疾病的诊断、 预后效果判断、环境质量的监测等方面。研制了白血病的免疫分型芯片，有助于临床分型、判断预后、指导治疗。目前免疫分型是白血病临床治疗及基础医学研究的一个重要手段。 白血病的免疫分型现在仍以流式细胞术（ FCM）方法为主，目前一次最多能检测到6 种抗原。我们研制的细胞免疫芯片检测技术， 一次可以检测数十种细胞表面抗原， 而且无需标记。图 6 细胞芯片检测仪5. 基于凝胶基因芯片的 SNP检测平台：将丙稀酰胺修饰的核酸与丙稀酰胺单体、 过硫酸胺等混合后点样于丙稀酰胺修饰的玻片上， 然后置于真空， 在引发剂汽化

9、的氛围下促其发生聚合反应形成凝胶并固定于玻片上。 通过该方法， 不仅可以固定合成的、 修饰有丙稀酰胺的寡核苷酸及其类似物， 还可以固定修饰了丙稀酰胺的 PCR产物。这种在凝胶内三维的固定量比平面的固定量成指数级的提高。 杂交后，用电泳替代传统的清洗方法 , 可以更好地提高信噪比和有效地区分完全匹配的序列和错配的序列。以上方法我们用于疾病相关的功能 SNP的检测上，由于凝胶的固定量大 , 可通过多重 PCR 一次固定多个位点的 PCR产物。每一位点用一对分别标记 Cy3和 Cy5的寡核苷酸探针与芯片杂交，用电泳方法区分单碱基错配，通过扫描结果呈现的、黄、绿三种颜色很容易将每一位点的 SNP分型

10、, 使得 SNP的检测更加真实可靠、简便、低廉。随着人类基因组计划测序任务的完成， SNP的研究成为后基因组计划中重要的组4 / 7成部分，特别是与人类的生命代谢、疾病相关的 SNP，国内外众多的研究所、医学院，乃至大的制药企业都投入大量的财力、人力从事该领域的研究。我们的SNP检测平台由于可靠、简便、低廉的优势，在众多的 SNP检测方法中更具竞争力。目前已经为江苏省人民医院、 南京中大医院、 汕头大学医学院等多家单位提供服务，均得到满意的结果。6. 硅烷化寡核酸探针 :DNA的固定在传感器、 DNA固相扩增（ PCR）、核酸键合、基因芯片及蛋白质芯片等生命科学和医学诊断领域中被广泛使用。 因

11、此，合成短片段寡核酸的修饰具有广泛的市场。 目前核酸的修饰主要采用进口的亚磷酸酰胺试剂， 按照普通DNA合成的方法固相合成。 该试剂我国目前尚不能生产， 需要进口，且价格昂贵；由于亚磷酸酰胺试剂的反应活性高， 很容易与水等亲核试剂发生反应而失活， 在储存、运输和使用上十分不便， 试剂浪费严重。 硅烷化寡核酸探针是通过硅烷化试剂合成的修饰寡核酸， 其价格低廉。 硅烷化试剂是一种种类繁多、 相对活泼的化学试剂。例如氨基硅烷、巯基硅烷、丙烯酰胺基硅烷等等，其国产价格大多在50 元/500 毫升左右。硅烷化寡核酸探针具有传统修饰寡核酸的性质：产品为无色粉末，极易溶于水； 在 20下能稳定一年； 产品在

12、碳酸盐等缓冲溶液等中溶解点样于醛基等修饰的玻璃载片上能得到有效的固定； 固定的核酸与能够有效的与互补序列杂交。 该技术已获 2005 年国家新产品编号 2005ED105019，核酸探针已广泛 DNA芯片制备，固相 PCR以及各种检测核酸， 蛋白质分子的及传感器的制备。随着基因芯片技术的不断成熟及其应用领域的不断拓广， 核酸探针的市场需求量将进一步增加。 市场将涉及对疾病， 病原体以及其它生物物质的诊断与检测及分子生物学相关的大专院校、 研究机构、 医院、疾病预防和控制中心及环境监测等单位，具有较大的市场。7. 基因甲基化定量检测技术：本成果采用 Q-MSP结合 MSP及实定量 PCR技术，同

13、时具有 MSP的特异性和灵敏性以及实时 PCR的快速和抗污染等特性， 可对微量 DNA的甲基化进行精确定量分析。我们利用该技术对 30 例骨肉瘤组织及相应的正常组织的 5 个基因进行定量甲基化分析。 结果说明， 异常甲基化水平与肿瘤的病理分期密切相关， 它可以5 / 7作为一个有用的分子标记来协助判断肿瘤的发生程度及预后效果。 本研究的结果撰写的文章已被美国癌症协会主办的权威杂志 CANCER接收。8.PCR共聚焦生物芯片扫描仪：本成果是将基因实时定量扩增技术与基因芯片技术进行有机融合，将探针固定在芯片上，通过基因扩增的同时水解探针原理来实时监测，实现基于基因芯片的基因定量检测。该仪器设计了高

14、精度的温度循环控制系统和基因芯片的荧光多次扫描技术为一体， 通过软件的控制， 实现对基因芯片的在片扩增过程进行实时图 7 PCR 共聚焦生物芯片扫描仪的监测，计算出荧光的增减变化的标准曲线。通过待测基因与标准参照体系的对比，从标准曲线上查找实测样品对应的检测探针的荧光强度变化过程确定待测样品的相对基因含量。 该成果的多基因同时定量检测能够在医学、食品及生物安全等方面具有广泛的应用前景。9. 中药材（石斛）鉴定特异性 gDNA探针的筛选与应用本成果以名贵中药材石斛为实验材料， 探索了在全基因组内筛选种特异性探针，并建立了多种特异性探针进行中药鉴定的 gDNA芯片新方法，对石斛样本进行了准确鉴定。本研究成果是将抑制性差减杂交与基于尼龙膜微阵列杂交相结合筛选种特异探针。即先用抑制性差减杂交获得两个品种之间的 gDNA差异片段，然后用这些 gDNA差异片段与由所有研究品种的 gDNA制备成的微阵列杂交筛选到某一个品种的特异性 gDNA片段。研究证明了建立的种特异性 gDNA探针的筛选方法是可行和高效的。该研究成果发表在核酸研究和生物化学和生物物理学方法杂志上。用从 5 种石斛中筛选到的 14 个种质特异性探针点样制备成微阵6 / 7列成功地对 5 种常见的石斛品种其中包括 中国药典收录的 3 种石斛进行了鉴定。建立了 DNA微阵列鉴别不同的商品石斛