遗传病的基因诊断参考幻灯片.ppt

1、遗传病的基因诊断,药学2班 辛鑫,1,一、基因诊断的概念及常用技术,2,基因诊断利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测基因的存在,分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。,（一）基本概念,3,（二）基因诊断常用方法,核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术,4,1、核酸杂交,基本原理-核酸变性和复性理论 即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。,5,6,核酸杂交的关键要素,probe DNA target DNA sign

2、al detection,7,核酸杂交方法分类,按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。,8,固相杂交分类,Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交,9,Southern blot 是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。,10,Northern杂交 用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。,11,斑点杂交（Dot

3、blot）,可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。,12,原位杂交（Colony in situ hybridization）,可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。,13,2、利用PCR及结合其他技术进行基因诊断,直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位

4、基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊断 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基因诊断 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析,14,寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交 （ASO）,15,3、 DNA序列测定,DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。,16,4、 DNA芯片技术,应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。,17,（三） 基因诊断的特点,高特异性 高灵敏度 获得稳定的结果 早期快速 适用性强，应用范围广,18,二、

5、 遗传病的基因诊断,（以血红蛋白病为例）,19,（一）血红蛋白病概述,血红蛋白由四条链组成，两条链和两条链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。,20,21,血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀。,22,（二）血红蛋白病的分类,异常血红蛋白病：Hb结构发生了变化 导致贫血病 如：镰刀状细胞贫血 地中海贫血：组成Hb的珠蛋白很成降低 或消失

6、，Hb的结构不发生 变化 亦称：珠蛋白合成障碍性贫血,23,（三）镰状细胞贫血,红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。 患者多在成年以前死亡,24,Mst酶切位点(CCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,1、镰状红细胞贫血分子机制,5 67 -Pro GluGlu -CCT GAG GAG-,5 67 -Pro AlaGlu -CCT GTG GAG-,25,2.镰状细胞贫血的基因诊断方法,常用方法有限制性内切法（RE），ASO，ARMS，跨越断裂点的PCR技术（裂口-PCR） 最常用的是RE,26,限制性内切酶/Southern blot 采集制备血液DN

7、A内切酶Mst消化电泳转膜32P标记的珠蛋白cDNA杂交放射自显影,27,28,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,29,PCR/限制性内切酶 设计引物PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切电泳EB染色直接观察 例： 引物1：5-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3 引物2：5-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3 扩增产物294bp,30,引物1,CCT GAG GAG,CCT GTG GAG,引物1,引物2,引物2,294bp,103bp,191bp,Mst酶切位点(CCTNAGG),31,

8、103bp,191bp,294bp,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析,32,（四）、地中海贫血(Thalassaemia,简写thal或T),珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少（）或完全缺失（0） 珠蛋白合成速率降低，导致链和链合成的不平衡多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上改变了膜的通透性和硬度导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。 缺乏有效治疗措施。,33,1、 地贫病的分子基础,珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子（IVSI和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约20种； 一般对特定种族来说，90%的地贫基因仅由46种突变组成。,34,2、 地中海贫血的基因诊断,PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（46对，分别标记） 制备DNA样品 PCR扩增 斑点印迹杂交 RFLP分析法,35,c,左侧缺失4.2kb,右侧缺失3.7kb,b,b,b,a,2,1,1,2N端1