月季组织培养

1、目录摘要4前言4综述51外植体51.1取材部位1.2取材时间1.3取材大小2. 消毒83. 接种方式84.培养基94.1基本培养基4.2激素4.2.1不同激素对诱导愈伤组织的影响4.2.2不同激素对继代培养的影响4.2.3不同激素对生根培养的影响4.3糖浓度的影响4.4无机盐4.5琼脂5.培养基的配置136.培养条件147防褐化14技术路线与实验设计15参考文献17摘要：为了进行月季组织培养实验，我们查阅了相关文献，从多个方面了解影响月季组织培养的因素，如外植体的取材部位、时间、大小、消毒、接种方式、不同阶段激素的配比、培养基成分、培养条件等，以期在实验中调控月季组培的环境，确保实验顺利进行。

2、基于我们想探究激素对组织培养中细胞的脱分化和再分化的作用这一想法，我们的设计了以浓度、浓度、外植体部位为影响因素的正交实验（L9（3），并考察NAA与6BA的交互作用。同时，我们还以接种方式作为单因素考察其对愈伤组织诱导的影响。关键词：组织培养、影响因素、正交前言在阅读了植物组织培养的相关文献资料后，我们设计了此次组织培养实验方案，考察细胞分裂素浓度、生长素浓度、接种方式、取材部位因素对愈伤组织的形成有何影响，期望寻找出诱导月季愈伤组织的最佳条件；同时探究由愈伤组织诱导出芽及生根所需的最佳浓度配比。并在月季组织培养过程中，掌握外植体消毒方面要注意的事项，整个培养过程中培养条件的选取与控制，实验

3、过程中出现的现象的观察记录以及分析，在这个过程中不断加强理论与实践的联系，深化对理论知识的理解。对于外植体选择，我们采用了以往研究者的做法，即选用带腋芽的枝条。但是，我们的不同之处在于，我们还保留了一部分刚好能包裹住腋芽的叶柄。这样做的目的是为了在消毒时避免芽受到太大损伤。参考论文中防褐化多用抗氧化剂和其他抑制剂，减轻外植体在组培中的酶促褐变，我们根据生理生化原理，考虑到酶活性与温度有关、以及外植体内的酚类物质含量有关，因此需对外植体做如下处理：接种前先将外植体用低温水流冲洗24小时；选择晴朗天气采摘外植体。激素浓度的选择：由于不同种的月季对浓度的需求有差异，我们是以前人得到的最适浓度为中间值

4、，设置了不同浓度，试图探究我们所培养的月季品种所需的最适宜浓度。培养条件：我们决定采用一般植物组织培养的条件，如温度控制在24左右，光照时间为12h/天。考虑到光对褐化的影响，我们计划接种后暗培养一周后，再光照下培养。培养基的配制方面，我们着重考虑pH对培养基的影响。通过查阅文献，激素加入MS培养基后将pH调为6，配置铁盐过程中同样注意pH的调节。 组织培养的每个步骤均有可考察因素，很多细节需要把握，在实验过程中不断吸取经验和教训，学以致用。因此我们希望通过实验深入学习植物组织培养的基本过程和基本方法，了解组培的经济意义和实用价值，能够广泛应用于生产，进一步实现理论与实际应用的相互转化。综述1

5、. 外植体1.1取材部位外植体一般选取生长健壮的当年枝条的饱满而外萌发的侧芽1。李青等分别选取一年生枝条的冬牙当年生枝条腋芽作为外植体，相同条件下培养发现越冬牙的成活率较高，且从接种到萌芽时间短，生长快，在后代繁殖中植株健壮1。本实验材料取自盆栽的丰花月季，剪取腋芽尚未萌发的枝条，去除茎段两端各2毫米选芽以茎段中芽为最好，因为接种后，中段芽第5 天左右就能萌发，而基部和稍部的芽往往迟至15 天才萌发2。用“和平”品种月季的枝条，均等分为6 段，取每段的一个侧芽培养在无激素的MS 基本培养基上，2-3 天即可见接近枝条最顶端和紧挨着枝条基部的芽发育最慢，而枝条中的芽发育比较快2。不同外植体的脱分

6、化能力不同，诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状态也存在较大差异。以叶片和茎段为外植体诱导得到的形态上差异不明显，愈伤组织多数呈乳黄色部分呈绿色，白色，松散，程度不一，叶片诱导率稍高于茎段能达到90%以上，选取好的经2-3代的继代培养可获得较疏松的，适宜于细胞悬浮培养的愈伤组织；叶柄为外植体主要是在基部及切口处形成愈伤组织，接种后生长极其缓慢，接10D时可见边缘切口处发生褐化，得到愈伤组织少；因此认为叶片和茎段是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想材料3。1.2取材时间外植体的取材部位对芽的萌发也有影响。外植体的取材时间及培养所需时间对月季嫩茎的发育和增殖也有影响。对于“Bulgarian ro

7、se”而言，选取外植体的最佳时间是冬季4。外植体的取材时间及培养所需时间对月季嫩茎的发育和增殖也有影响。对于“Bulgarianrose”而言选取外植体的最佳时间是冬季(1-3月)(321；而“Improvedfire”月季的培养时问以28d继代一次较好，超过28天，茎的数目就不再增加了5。1.3取材大小取无菌苗叶片切成0.5cm0.5cm的小块，叶柄，茎段切成小段3。外植体很小时，有利于培养脱毒的植株对月季的杉树坏疽环斑病毒(Prtmus necrotic ringspot virus，PNRSV)可通过茎尖培养的方式达到脱毒的目的，如果单纯为了快速繁殖，可用大的茎尖或茎段进行离体培养，这时

8、外植体的大小决定了茎尖的成活比例。一般说外植体愈大，成活率愈高，成苗时间愈短。茎尖在1-10mm长短时，对形成多芽苗最有效，不但多芽苗所占百分率高，而且每个茎段的侧枝数也比较多。外植体的大小同时影响外植体自身的发育和月季组培苗茎的增殖，外植体的长度在9.0-10.0mm，直径在3.0-3.5mm范围时茎的增殖和发育是最好的。但Horn对某几种月季进行微繁实验时发现外植体的大小对茎的增殖、叶片数目没有影响，其他一些研究者对只有个茎节的“Sweet Promise”进行组织培养中得到了类似的结论5。 2. 消毒 接种材料为当年抽生侧芽饱满的幼嫩茎段，自来水冲洗10-20min；75%或70%乙醇浸

9、泡30s,0.1%升汞表面消毒3min,无菌水冲洗4-5次，将侧芽切下接种到MS培养基上，获得无菌苗备用3。 取回枝条用自来水冲洗干净，无菌条件下用70%酒精表面消毒30-40s，再用0.1%Hgcl2溶液灭菌5-10min，最后用无菌水冲洗3-5次1。 组织培养中的污染源大致可分为三类：外界环境污染，植株内生菌和外植体处理不当。因此，可在试验过程中每隔一段时间用巴斯德消毒液喷洒培养室；对培养基，工具的高压灭菌要彻底；试验员要在进入超净太之前用1.0%巴斯德消毒液擦手；接种时工具和手不要在培养基上方搅动，以防止细菌落入其中；探索适宜的消毒处理时间。此外，防止细菌特别是内生菌污染，很重要的措施是

10、在培养基中加入抗生素63.接种方式 在外植体的接种中采用了垂直接种，斜向上45度接种，水平接种和反转接种4种方式，发现垂直接种和斜向上45接种，水平接种和反转接种4种方式，发现垂直接种和斜向上45度接种是最佳的接种方式，腋芽再生芽数多，且生长健壮，这可能与植物的生长极性有关1。4.培养基4.1基本培养基众多培养基中以 MS 培养基的效果为最好，广泛用于月季的离体快速繁殖中。对 MS 培养基的成分及物理性能进行合理的选择会提高月季组织培养的成功率4茎段培养阶段，将带有腋芽的嫩茎接种到不添加任何激素类物质的 MS 和 1/2MS 培养基上，两周后，MS 培养基上的腋芽生长，而在 1/2MS 培养基

11、上的腋芽几乎不萌发或发育不良4。MS培养基上愈伤个数最多达到32个，诱导率为35.5%；培养基上愈伤个数达到27个，诱导率为30%，培养4d后外植体叶的一端开始膨大，叶片切口处可见少数绿色愈伤组织；大小如沙粒，柔软，结构密实。而WPM，White在培养第二天外植体即有部分开始脱色变白，第三天有部分变黄，大部分褐变，最后枯死。可见MS，B5两种培养基对愈伤组织的诱导效果明显，结果表明，不同培养基对叶片诱导程度可排列为MSB5WPMWhite.94.2激素4.2.1不同激素对诱导愈伤组织的影响诱导培养基以为基本培养基，附加适量的细胞分裂素6-BA和NAA。NAA增加至0.1mg/L时，6-BA浓度

12、的高与低已对增殖系数不产生明显影响。最适的侧芽诱导培养基为MS+6-BA0.5-3.0mg/L和NAA0.01-1.00mg/L，且培养基中添加蔗糖有增加丛生芽数量的作用1。激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态，质地和分散性。单独使用细胞分裂素没有愈伤组织形成，对正交研究进行极差分析，各因素对愈伤组织诱导率的影响作用：2,4-D浓度KT浓度BA浓度NAA浓度。最佳愈伤组织诱导组合是：KT2mg/L NAA2mg /L+2,4-D 1 mg /L3。BA用量及侧芽在茎段上的位置对侧芽发育的影响。在不同浓度BA的MS培养基上，BA含量为0.03-0.3毫克/升的培养基促进侧芽的发育，若超过0.3

13、mg/L则延迟芽的发育，但对于茎段中部的芽影响较小7。不同生长素种类和浓度对月季生根和移栽成活率的影响。以“彩云”为材料，用NAA 诱导生根和提高移栽成活率效果最好，浓度为100ppm 为宜，现在IAA 诱导生根和提高移栽成活率效果并不理想，其浓度只能在1mg/L 以下,超过时对生根的促进作用已不显著,反而大幅度降低移栽成活率。NAA和IBA对月季的诱导生根都有较好的效果,在1/2MS培养基附加NAA或IBA0.1-1.5mg/kg均可诱导不定根的产生,生根63.3%-93.3%8。4.2.2不同激素对继代培养的影响低浓度的6-BA有利于不定芽的增殖，浓度过高则抑制不定芽的增值，适量NAA有利

14、于芽和叶生长。在NAA浓度相同而BA浓度不同的培养基中，随BA浓度的升高，芽苗的增殖系数也相应提高。此外，增殖系数还与品种有关。从增值倍数、叶片数。再生芽长势等综合因子来看，MS+BA0.5-02.0mg/L+NAA0.01-0.05mg/L是最适的不定芽增殖培养基1。NAA浓度为0.5mg/kg时对生根是较为适宜的浓度,而不必向在诱导植物芽分化时必须按一定比例配比细胞分裂素与生长素混合使用8。将上述无菌芽从原茎段上切下转接到MS+BA1-2+IAA0.1-0.3或MS+BA1-2+NAA0.01-0,1的培养基上促使嫩茎长出更多的侧芽，原茎段弃去。继代增殖培养基每升用蔗糖30克7。4.2.3

15、不同激素对生根培养的影响多数实验采用的培养基为1/2MS(大量元素减半）。Skivrin等在用“Forever yours ”月季做生根试验时发现，采用1/4MS培养基，不加生长素可以促进生根。利用1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭诱导生根，生根率最高90%，且随着随着活性炭百分比的加大，生根率逐渐下降。活性炭的加入能显著促进生根量和根的长势，但又含活性碳的培养基只见较少发根，且根细弱，说明植物激素对于生根是必不可少的。MS培养基中盐浓度过高，特别是氮含量过高会导致生根不适应，所以需减少无机盐用量1。4.3糖浓度的影响不同类型的月季，其组培要求的碳源和糖浓度有所不同。月季组培最常用的碳源

16、是蔗糖，在丰花月季的组织培养中，初代培养的蔗糖含量为5%，继代培养的蔗糖含量为3%时培养效果最好9。4.4无机盐试验证明，全量的MS无机盐对茎增殖效果最好5。无机盐浓度和含糖量对月季生根的影响。采用较低浓度的无机盐对月季生根效果较好。但糖浓度不可降低。否则削弱苗的生长势，试验证明，1/2MS+30克/升蔗糖利于生根10。Hyndman认为 MS 培养基中的氮盐含量是影响月季生根的主要因素，把 MS 培养基中氮素含量从 60mmol/l减少到 7.5mmol/L（相当于 1/8MS 中的氮素含量）时，嫩茎生根效果良好，保持 7.5mmol/L的氮素含量，MS 培养基中其它无机盐的浓度减少到原配方

17、的1/16，对生根没有影响；但氮素含量过高会引起月季组培苗的生根不适4。4.5琼脂 培养基中的固化支持物，并非完全不起作用的物质，它含有能影响外植体的物质，培养基中大约有十分之九的固化支持物是琼脂，月季组织培养中，琼脂的种类和产品质量的差异会影响芽的发育与增殖：月季的侧芽在纯净的琼脂BD上发育较好，而在Merck1614和不纯净的BD上发育较差，但目前尚未有较好的方法检测琼脂的质量。现在已经有人成功地利用其他支持物替代价格昂贵的琼脂，月季试管苗在蛭石作固化物的培养基上的生根率几乎与琼脂作固化物的培养基上的一样，而移栽成活率却高于琼脂作固化物的培养基培养的月季 10 。5.培养基的配置配置母液和

18、激素时应注意的事项：（1）配置母液时，各种化合物一定要单独充分溶解后再倒入容量瓶中定容，避免其中的离子之间发生沉淀(2）激素一般难溶于水，所以生长素用少量0.1mol/L NaOH溶液，少量0.1mol/L HCL溶解，然后用蒸馏水或去离子水定容6。6.培养条件（温度、光照、PH、无机盐）诱导和继代培养均在黑暗条件下进行，培养温度为25，3-4周更换一次培养基。3次重复。培养温度21最好最高不超过25，有昼夜温差，生根阶段对温度变化非常敏感，生根温度保持在21度左右，光照10-12h/d，光强800-1200LX。结果发现,在不同的温度下其生长情况有很大的差异。在21时嫩茎生根数目最多,而且嫩

19、茎生根的百分率也最高,然而在温度低于或高于21时,嫩茎生根数目均较21时减少,同时嫩茎生根的百分率降低,呈现出一个明显的生根数量变化趋势8。7防褐化 对于较易褐化的植物，在培养过程中应在接种后进行一段时间的遮光处理或暗培养；缩短培养基更换时间，接种后1-2天即转至新鲜培养基中。此外，在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂，可以有效地减轻外植体在组培中的酶促褐变，因此可选择在培养基中加入抗生素（如VC），活性炭 等6。外源激素2mg/L 6-BA易引发褐变，应用时可考虑少量添加。2mg/L Kt和2mg/L NAA对组织褐变影响不大，考虑使用；使用乙醇消毒剂时，对外植体泡的时间不能过长，建议以5-1

20、0为佳；全光照条件培养容易诱发褐变，采用仿人工气候条件培养较其他条件培养科有效抑制褐变的发生，条件允许时推广使用4。虽然我们培养的是木本植物，防褐化也是我们要注意的问题。特别是王的关于外源激素2mg/L 6-BA易引发褐变，观点新颖值得重视。我们可以在分析实验结果时，把褐变和6-BA浓度关系进行简要分析。 外植体的大小对褐变的发生及褐变程度有一定影响. Bonga认为外植体越小,切面与体积的比率越大，伤害及褐化的程度就越大;相对大的材料褐变的程度较轻.除了机械伤害外，接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变，酒精消毒效果较好，但对外植体伤害很重;升汞对外植体伤害比较轻。一般来讲，外植体消毒时间越长，消毒效果就越好.11技术路线外植体愈伤组织芽分化芽增殖根月季愈伤组织诱导的正交试验设计因素水平水平 因素 NAA浓度mg/L 茎段 6-BA浓度mg/L 1 0.1 上部 0.5 2 0.2 中部 1.0 3 1.0 下部 2.0 月季愈伤组织分化成不定芽的实验设计水平 因素 6-BA浓度mg/L NAA浓度mg/L 1 0.1 0.012 0.2 0.053 0.5 0.10以1/2MS+NAA作为生根培养