第13章+遗传病的诊断.ppt

1、第十三章 遗传病的诊断,（diagnosis of hereditary disease),遗传病诊断包括： *现症患者诊断 *症状前诊断 *产前诊断（植入前诊断）,第一节 现症患者诊断 (symptomatic diagnosis),一、常规临床诊断 1. 病史的收集 一般病史：患者的一般发病情况。 家族史:本病在家族中的发病情况。 婚姻史：有无近亲结婚等。 生育史:生育年龄，子女健康状况；有无流产、 死产、早产；有无药物接触史、放射线 接触史等。,2.症状和体征的了解 遗传病的症状和体征有和其它疾病的共同性，亦有遗传病本身的特殊性。 除注意遗传病的特异性征候群，还应注意身体发育，智力发育，

2、性器官发育情况。 3.临床辅助检查 包括实验室检查、X线、超声、心电图、脑电图、CT等。,二、 系谱分析 pedigree analysis,系谱分析往往是由先证者的症状、体征、实验室检查和其它辅助检查作出疾病的诊断后，追溯到家系中其他成员，写出系谱图。,在绘制系谱过程中要注意： 1.系统、完整 *系谱成员应调查三代以上，（包括死者） *凡有近亲婚配、死胎、流产和婴儿死亡等，也须询问清楚，记录在系谱中。 2.去伪存真 注意区别病人和家属所提供信息的真伪。,3.注意新的基因突变 没有家族史的先证者应考虑是新的基因突变。 例如：假肥大型肌营养不良（ DMD）约有1/3的病例为新的基因突变引起的。一

3、般认为是由于患者母亲卵子形成过程中X染色体上DMD基因突变所致。,对系谱的分析要注意区别：,1.孟德尔遗传病 包括AD遗传病、AR遗传病、XD遗传病、XR遗传病、YL疾病等。 系谱分析对这类疾病的分析非常有用，分析时要考虑到某些疾病的遗传异质性、不规则外显、外显不全和延迟显性等情况，可能会造成一些临床假象，由于遗传的异质性可能将不同的遗传病误认为同一种遗传病进行分析。,2.非孟德尔遗传病 线粒体遗传病 ： 线粒体基因突变所致的遗传病只通过母系遗传，女性患者的子女都可能患病。线粒体遗传病表现为晚发、进行性。 多基因病： 其家族性聚集性可能类似于孟德尔遗传，但不严格遵循孟德尔分离规律。,3.具有特

4、殊遗传学现象的疾病 基因组印记 来自双亲的等位基因和染色体区域的表达不是等同的，这些等位基因在传递上符合孟德尔规律，但在表达方面受传递的双亲性别影响,因而产生母源印记或父源印记时，在系谱分析中要加以注意。,动态突变 在孟德尔遗传疾病中，突变后的基因在世代传递中稳定存在，但在三核苷酸重复序列扩展所致的遗传病中，处于突变状态的基因在世代传递中表现为不稳定，其重复单元的数目发生改变。,（一）染色体检查 又称核型分析（karyotape analysis)，即通过血液或组织培养制备染色体标本，进而显带、显微摄影，分组排列对比分析。 是确诊染色体病的主要方法。随着显带技术的应用以及高分辩率染色体显带技术

5、的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。,三、细胞遗传学检查,1.标本来源： 现症病人外周血和身体的各种组织 2.染色体检查适应症： 智能低下、生长迟缓或伴有其他先天畸形者。 夫妇中有染色体异常，如平衡结构重排、嵌合体等。 家族中已发现染色体异常或先天畸形个体。 多发性流产的妇女及其丈夫。 原发闭经和男女不育症者。 35岁以上的高龄孕妇。 有两性内外生殖器畸形者。,（二）性染色质检查 利用发根鞘细胞，皮肤或口腔上皮细胞，绒毛和羊水细胞检查X染色质或Y染色质。用于两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断。 优点是方法简单，有一定价值，但确认仍需

6、依靠染色体检查。,1.X染色质检查 用于由于X染色体数目异常而引起的性染色体畸变综合征检测。 如：Turner综合征 X染色质为阴性。 Klinefelter综合征 X染色质为阳性。,2. Y染色质检查 Y染色质检查适用于具有一个或一个以上Y染色体的个体或细胞群。如正常男性只有一个Y小体而XYY男性有2个Y小体。 可用于性别的鉴定。,（三）染色体原位杂交,应用标记的特异性DNA探针与玻片上的细胞中期染色体或间期核的DNA或RNA杂交，在这些核酸不改变其结构和分布格局的情况下，研究核酸片段的位置、相互关系，因此称为原位杂交。,荧光原位杂交（FISH）： 用生物素、地高辛配基等标记物标记的DNA探

7、针进行原位杂交后，用荧光标记的生物素亲和蛋白和抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和放大，使探针杂交的区域 发出荧光，这种原位杂 交称为荧光原位杂交。 可完成非整倍体的检测。,利用FISH技术诊断Down综合征,图示：利用21号染色体特异性探针对一位高龄妊娠妇女进行产前诊断，未培养的羊水细胞进行荧光原位杂交, 显示所检测的细胞均有,3个杂交信号,经选择性人工流产后确诊为Down综合征患儿。,四、生物化学检查,单基因遗传病往往是由于基因突变导致酶和蛋白质的改变或缺如，使一些器官的发育和正常的代谢发生改变，并在临床上表现出一系列症状。 因此，酶和蛋白质的定性和定量分析可反映基因结构的改变，是诊断单基因病的

8、主要方法之一，由于主要采用生化手段故称之为生物化学检查。,（一）酶和蛋白质的分析 利用血液和特定的组织，细胞对酶的活性和蛋白质的含量进行检测。主要方法有：电泳技术，酶活性检测，层析技术，免疫技术，氨基酸顺序分析技术等。 （二）代谢产物的检测 利用血液，尿液和羊水对代谢产物进行质和量的检测。主要方法有：血液滤纸片法，显色反应。,五、 基因诊断 gene diagnosis 采用分子生物学方法在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。 基因诊断特点: 针对直接病因诊断。 特异性强,灵敏度高。,适应性强,诊断范围广,因基因探针可为任何来 源、任何种类,其探针序列可为未知或

9、已知,待 检测的目的基因可为一个特定基因或基因组合。 目的基因是否处于活化状态均可,无组织和发 育特异性,因此可用于检测一些具有组织表达 特异性和分化阶段表达特异性的基因。,（一）基因诊断的基本技术 * 分子杂交技术 * 聚合酶链式反应(PCR)技术 * DNA序列测定技术 * 基因芯片技术,分子杂交技术 molecular hybridization 原理：双链DNA在加热到一定温度以上或在碱性溶液中会变性成为两条单链，互补的两条DNA单链在一定条件下结合成为双链。即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。

10、,因此 ，当一段已知基因的核酸序列作为探针，与变性后的单链DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。,基因探针（Probe）： 是一段带有标记的，与待测基因有关的核酸序列。 探针种类: 基因组探针（genomic probe） cDNA探针（cDNA probe） 寡核苷酸探针（oligonucleotide probe）,杂交方法： Southern杂交 Northern杂交 斑点杂交 液相杂交 夹心杂交 原位杂交 寡核苷酸探针杂交,1.Southern印迹杂交,2.斑点杂交法 又称等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针杂交。

11、用人工合成的20个碱基左右长度的ASO探针，一般要合成两种探针：正常探针，突变探针。 将待测的细胞或DNA直接点在硝酸纤维膜或尼龙膜上，将标记有同位素（或其他标记）的变性探针与其进行杂交，通过放射自显影，判断受检基因的有无以及基因的拷贝数，进行基因诊断。,ASO斑点杂交,1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸探针进行基因诊断。,聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR 聚合酶链反应技术是在体外迅速的选择扩增特定的靶DNA的方法。又称体外DNA克隆技术。PCR的原理： （1）按靶DNA片段的5和3端的碱基顺序各合成两条引物（长约20个碱基的寡核苷酸）； （

12、2）将待测DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP），引物和耐热DNA聚合酶（Taq 酶）；,（3）反应液进行热 循环，每一周期经过 变性（92-95）， 复性（40-60）和 延伸（65-72）三 个阶段产生倍增的DNA。 一般进行20-40个周期。,PCR相关技术及应用： 多重PCR RT-PCR Amp-FLP PCR-ASO PCR-SSCP 定量PCR PCR-DGGE,PCR-SSCP,1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。,1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟) 左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者,PCR-SSCP,DNA测

13、序技术(DNA sequenceing Maxan和Gilbert首先建立了化学方法，Sanger建立了DNA测序的酶学方法。 最新的DNA自动测序法以不同荧光色素标记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成反应，经过凝胶电泳分离，应用激光分析及计算机处理就能直接读出碱基顺序。极大地推进了生命科学的发展和人类基因组计划的进程，而且测序的长度可以达到1000bp以上。,DNA测序（DNA Sequencing)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。,基因芯片技术 基因芯片技术是近年 来发展十分迅速的大规模、 高通量分子检测技术。其 基本原理是核酸杂交，其基本过程是将许多特定的寡核

14、苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成矩阵点。现在的技术可以做到在1cm2上排列成千上万个“点”。,样品DNA/RNA通过 PCR扩增、体外转录等 技术掺入荧光标记分子， 然后按碱基配对原理进 行杂交，再通过荧光检 测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，得出所要的信息。,（二）基因诊断的途经 1.直接诊断 检测突变基因 直接诊断是直接检测致病突变的基因。它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病。,当致病基因的某种突变类型与发

15、病有直接的因果关系,或者对致病基因以及分子机制已完全了解,或者对致病基因以及分子机制部分了解但已知其中规律,可应用此途径。,2. 间接诊断 基因连锁分析 当致病基因虽然已知但其异常尚属未知或突变类型较多时；或致病基因本身尚属未知时，但被检测基因有紧密连锁的DNA多态标记，可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。,连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技术均可用于连锁分析。,（三）基因诊断的方法选择：,各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同

16、的基因异常，但这些异常大体可分为基因缺失和突变两大类型。根据对基因异常类型的了解，可以采用不同的诊断方法。,遗传的基因诊断方法 基因异常 方法 探针、引物或限制酶 基因缺失 基因组DNA印迹杂交PCR扩增 缺失基因的探针 引物包括缺失或在缺失部位内 点突变 RFLP分析ASO杂交 突变导致其切点消失的限制酶 PCR产物的多态性分析 正常和异常的ASO探针 （RFLP、SSCP、DGGE） 引物包括突变部位 基因已知 基因内或旁侧序列多态性 基因内或旁 但异常不明 （RFLP、 SSCP、AMPFLP） 侧序列探针或引物 连锁分析 基因未知 与疾病连锁的多态性， 与疾病连锁的多态 如SSCP、A

17、MPFLP连锁分析， 位点探针或引物 RFLP位点单体型连锁分析,（四）基因诊断在遗传病诊断中的应用 1 对单基因病的基因诊断 （1）点突变型遗传病的基因诊断,镰形细胞性贫血的基因诊断,镰状细胞贫血(HbS)： 第57位密码子,Mst： CCTNAGG,A： CCTGAGGAG S： CCTGTGGAG,ASO Hybridization,无过氧化氢酶血症（acatalasemia) 是一种常染色体隐性遗传病，患者过氧化氢酶活性只有正常人的0.2%0.4%，杂合体血液中过氧化氢酶活性则处于中间水平。过氧化氢酶基因由13个外显子和12个内含子组成。 应用32P标记PCR反应中底物 方法，扩增第4

18、个外显子和内 含子附近的203bp片段，应用 SSCP法可清楚地判断患者和 杂合体。,aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/-,14kb 10kb,10kb 4kb,BamH I,BamH I,左侧：16号染色体上携有数目不同的基因 右侧：a基因探针杂交的结果, -地贫基因缺失的诊断,正常,贫血 症状,携带者,HbH,（2）基因缺失型遗传病的诊断,DMDBMD的缺失型诊断：,（3）基因异常不明的遗传病的诊断 以苯丙酮尿症( PKU )的基因诊断为例。 RFLP分析：,一个PKU家系的RFLP单体型分析,单体型分析,PKU家系PAH基因STR连锁分析,2多基因遗传病的基因诊断 人类基因

19、组多态性是多基因病基因诊断的基础，易感基因多态性的检测能帮助我们理解多基因病发生的机制，有助于对疾病的诊断和分类。 目前已经发现一些多基因病相关基因，如载脂蛋白E基因（ApoE）的多态性与阿尔茨海默病（AD）有高度相关性，血管紧张肽转换酶基因的多态性与原发性高血压和心肌梗死高度相关。,3 对肿瘤的基因诊断 ras基因突变的检测 ras基因突变的检测可采用PCR-ASO方法进行，已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子。 p53基因的检测 目前常用PCR法进行检测p53突变的热点是外显子5-8，一般可先选用外显子5-8的引物进行扩增，其后再进行突变位点的详尽分析，甚至测序。另一初步检测p

20、53基因突变的方法为PCR-SSCP，然后测序。,（五）疾病基因诊断的展望 未来的基因诊断主要发展方向 *胚胎着床前诊断在囊胚8个细胞期，通过对其中一个细胞的染色体核型分折和原位杂交，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段； *母体外周血中胎儿细胞分析技术； *对常见病、多发病如心血管系统疾病、糖尿病、精神疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、哮喘、近视眼等进行分子诊断。,第二节 症状前诊断 （pre-symptomatic diagnosis） 指在遗传病的临床症状出现前所作的诊断。 是针对一些常染色体显性(AD)遗传病的杂合子个体的一种诊断方法。这些个体往往发病年龄延迟，如果能在杂合子个体生育之前或

21、出现症状之前就作出诊断，可以避免他将致病基因传递给后代，减少遗传病的发病率。,常染色体显性杂合子个体的症状前诊断方法有三种： 1家系分析法和风险估计 2生化学检查 3基因分析 新生儿筛查（neonatal screening）也是一种症状前的诊断。是对已出生的新生儿进行某些遗传病的诊断，是出生后预防和治疗某些遗传病的有效方法。,第三节 产前诊断 （prenatal diagnosis）,产前诊断又称宫内诊断（intrauterine diagnosis）是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出准确的诊断。,一、产前诊断的适应征,135岁以上的高龄孕妇或夫妇一方有明显致畸因素接 触

22、史； 2夫妇之一有染色体数目或结构异常者；或曾生育过 染色体病患儿的孕妇； 3已知或推测孕妇是AR或XR携带者；曾生育过某种单 基因遗传病患儿的孕妇； 4曾生育过先天畸形（尤其是神经管畸形）的孕妇； 5有原因不明的自然流产，畸胎，死产及新生儿死亡 的孕妇。,二、产前诊断的方法,仪器诊断 包括：X线检查 超声波检查 胎儿镜检查 细胞学方法（染色体检查；染色质检查） 生化学方法（蛋白质或酶检查；代谢产物检查） 分子生物学方法（基因分析）,三、产前诊断的标本及采集技术,可用于检测的标本： 羊水上清液、羊水细胞 绒毛 脐带血、孕妇外周血中胎儿细胞 孕妇血清和尿液 受精卵、胚胎组织,羊膜穿刺术（amniocentesis） 羊膜穿刺术一般在妊娠1618周时进行。因为此时羊水量多、胎儿浮动，穿刺时