扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版)

1、相关仪器的信息：透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号） TEM，产地：日本超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本真空喷镀仪：EikoIB5ion coater，产地：日本包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、 取材：1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；2、减少

2、损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；3、组织块大小：一般要小于1mm3。二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人

3、员的指导。三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。脱水过程中应注意：I 逐级脱水而不能急剧脱水；II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4保存。五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。包埋剂配制及使用过程中的注意事项：I 所有容

4、器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；III配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10-20冰箱中，延长其使用期。表1 戊二醛溶液的配制终浓度1.01.52.02.53.04.05.00.2M PBS/ml5050505050505025%戊二醛水溶液/ml46810121620重蒸水加至/ml100100100100100100100表2 0.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制A液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 Na2HPO4 28.4g 或Na2HPO4.H2

5、O 31.61g或Na2HPO4.2H2O 35.6g 或Na2HPO4.7H2O 53.63g 或Na2HPO4.12H2O 71.64g加双蒸水至1000mL NaH2PO4 24.0g 或NaH2PO4.H2O 27.6g 或NaH2PO4.2H2O 31.21g加双蒸水至1000mL按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方pH值5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0A液8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7B液92.

6、0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。表3 多聚甲醛-戊二醛固定液的配制溶液名称剂量10%多聚甲醛溶液20ml0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液50ml25%戊二醛水溶液10ml重蒸水20ml表4 2%锇酸溶液的配制试剂用量锇酸/g1重蒸水/ml50表5 Spurr包埋剂配方药品名称硬配方软配方我们现用的配方VCD树脂10g10g10gDER7366g7g8gNSA26g26g26gDMAE0.4g0.4g0.4g注：通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE

7、的用量则调节聚合反应的速度。透射电镜样品制备程序：No.1 包埋切片样品的制作过程样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后按下列步骤处理样品： 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。 用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h； 用包埋剂

8、与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h； 纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察。1).Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three

9、times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer.2).Dehydration: The specimen was first dehydrated by a graded series of ethanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minute

10、s at each step, transferred to absolute acetone for 20 minutes. 3). Infiltration: The specimen was placed in 1:1 mixture of absolute acetone and the final Spurr resin mixture for 1hour at room temperature, then transferred to 1:3 mixture of absolute acetone and the final resin mixture for 3hours and

11、 to final Spurr resin mixture for overnight.4).Embedding and ultrathin sectioning: Specimen was placed in capsules contained embedding medium and heated at 70 for about 9hours. The specimen sections were stained by uranyl acetate and alkaline lead citrate for 15 minutes respectively and observed in

12、TEM of Model JEM-1230.No.2 负染样品的制作（以细菌为例）Negative staining of bacteriumThe bacterium suspension was stained by 1 to 2%solution of phosphotungstic acid (PTA，磷钨酸) in a pH range of 6.5 to 7.0 for 15 to 30 seconds. Then, the bacterium was observed in TEM of Model JEM1230.扫描电镜样品制备方法样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后

13、按下列步骤处理样品：倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min。用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。临界点干燥。镀膜，观察。处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30ESEM型环境扫描电镜中观察。Spurr低粘度包埋剂ERL-4

14、206 2.5gNSA 6.5gDER-736 2.0gDMAE 0.1g前三种试剂混合均匀后，加入DMAE，充分混合。按每个样品2.5g的用量配制。70聚合8h以上。干脆把透射电镜样品的制备方法一起发了：透射电镜样品制备方法样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后按下列步骤处理样品：倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用1

15、00%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在*JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察SEM需前处理样品制备过程中的注意事项I 取材：1cm3左右即可，不需要象TEM样品那么小；II脱水：样品较大，脱水时间可适当延长；III临界点干燥

16、：一般采用液体二氧化碳为置换液，二氧化碳与乙醇或丙酮互溶性较差，而与醋酸异戊酯互溶液性较好。因此，样品脱水后需逐渐过渡到醋酸异戊酯溶液中浸泡，以便置换存留于组织中的脱水剂。注意：醋酸异戊酯挥发性较强，应在通风橱中操作，废液用密闭容器装好后丢弃。IV 金属喷镀：新鲜样品自身就可导电，而经过干燥的生物样品不能导电。这种不导电的样品在SEM中观察时，会产生电荷积累而影响观察稳定性。使样品导电的方法通常是在样品表面喷一层厚度约100埃的金膜。No.1直接观察的扫描电镜样品I 样品粘附在样品台上，在Eiko IB5型离子溅射仪中喷镀4-5min。II样品在荷兰Philips公司的XL30型ESEM（环境

17、扫描电镜）中观察。Thespecimen was coated with gold-palladium in Eiko Model IB5ion coater for 4-5minand then observed in Philips Model XL30 ESEM.No.2需前处理的SEM样品制备程序样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后按下列步骤处理样品： 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用1%的锇酸溶液固定样品1-2h； 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min； 用梯度浓度（包括50%，70%，80

18、%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min。 用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。 临界点干燥。 镀膜，观察。处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30型环境扫描电镜中观察。I Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO4 in phosp