实验一 革兰染色法.ppt

1、微生物实验课注意事项,禁止不穿白大衣进入实验室； 禁止在实验室内吃东西、吸烟；不得高声喧哗，随 处走动； 严禁用酒精灯点燃酒精灯； 严禁把实验室内任何物品带出室外； 病原材料污染桌面、地板等或误吸入口，应立即报告教师进行处理； 爱护实验仪器设备，损坏仪器要赔偿； 实验完毕，废弃物放入指定地点，桌面理清洁，洗手后方可离室。值日同学负责打扫实验室，并关好水电、门窗方可离开。,实验一 革兰染色法,1.掌握油镜的使用 2.熟悉革兰氏染色法原理、 步骤、结果、意义 3.掌握细菌的基本形态和特殊结构,实验目的要求,细菌染色的方法,单染法:采用一种染料染色,只能观察细菌的形态和排列特征，不能观察细菌的染色特

2、性和进行鉴别。 复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。,革兰染色法,该染色法是丹麦细菌学家革兰于1884年创建的,至今仍广泛应用用于细菌分类和鉴别,革兰染色法的原理,渗透学说：与肽聚糖的结构有关 革兰阳性菌细胞壁主要由致密的肽聚糖网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，酒精不易渗透，反而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗出。 革兰阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄、交联度低，脂类含量高，酒精易渗透进入细胞内，将染料脱出。 化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关 革兰阳性菌细胞质中的核糖核酸镁盐与结晶紫-碘结合形成更

3、大的复合物，不易被酒精脱出。 等电点学说：与细菌所带电荷有关 革兰阳性菌等电点低（pI）为23，在中性或碱性环境中所 带负电荷多；革兰阴性菌pI为45，所带负电荷少，影响结合染色的多少,实验材料与方法,材料: 菌种：葡萄球菌和大肠埃希菌混合物（18-24h） 牙垢 试剂：结晶紫染液、碘液 95%酒精、稀释苯酚复红液 其他：玻片、接种环、酒精灯 无菌生理盐水、显微镜等,染色标本检查基本程序,初染1min,结晶紫,媒染1min,碘液,脱色15-20s,复染1min,复红/苯酚,95%乙醇,G+,G-,革兰氏染色步骤与现象,注意：每一步染色后水冲，甩干水,(1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适

4、当的视野。 (2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。 (3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。,涂片观察（P3）,P3,注意事项,1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。 如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。 脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格界定。,2. 染色过程中勿使染色液稀释。用水冲洗后，应吸去玻片上的 残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。,3. 选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄 太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,实验完毕后

5、的处理：,1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。,b.用擦镜纸沾少许二甲苯（）将镜头擦2-3次。,c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。,2.镜检后的染色玻片直接扔到专装废弃玻片的盒子。,染色结果,染色结果,螺形菌Spiral bacterium,革兰染色意义,鉴别细菌 选择抗菌药物 研究细菌的致病性,选择抗菌药物,常见的革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌 革兰氏阳性菌通常对青霉素类

6、、第一（或第二）代头孢菌素等高度敏感 ，青霉素可为化脓性细菌感染可首选药物 。,选择抗菌药物,常见的革兰氏阴性菌：沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、霍乱弧菌等。革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药 革兰氏阴性菌对第三代头孢、氨基糖苷类、抗假单胞菌属的青霉素类、多粘菌素等高度敏感，对头霉素类和第二代头孢菌素也较敏感。例如氟哌酸对革兰染色阴性杆菌有效，如肠道病、腹泻为常用药 。,研究细菌的致病性,革兰阳性菌可产生外毒素使人致病。 革兰阴性菌主要以内毒素使人致病。（ LPS作为G-菌内毒素致病 ）,实验步骤,观看鞭毛、荚膜、芽孢的示范片 绘图、写实验报告,细菌的特殊结构形态观察,细菌的特殊结构,芽胞(nuclear material ornucleoid),枯草杆菌芽孢的观察,芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各种极端环境。,细菌的荚膜