无菌检查法试验具体操作方法.ppt

1、无菌试验具体操作方法,实际应用及注意事项,Company Logo,分类,概述,试验物品准备,无菌操作的要求及注意事项,Company Logo,一、概述,无菌检查法系用于确定要求无菌的生物制品、原料、辅料及要求无菌的其他品种是否无菌的一种办法。 若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查在生产检定中是很重要的一个检项，如果出现差错会有很大的隐患，近年注册申报资料中无菌检查法验证的内容确实在日渐完整和规范。 2005年版中国药典无菌检查法增加了方法验证的内容，增加了试验的可操作性，方法更具有科学性，提高检出率。保证检验结果的准确性。,Company L

2、ogo,二、试验物品准备,1、培养基数量及选用： 首先要确认本次试验供试品所需培养基的数量。 在此基础，要多加一套相同的培养基做阴性对照。 合格的培养基应保存在2-25并防止被污染, 使用期限不得超过3周. 无菌试验对培养基的质量要求高，应选用完全透明无沉淀的培养基，确认检查合格后放入试管架中，置操作间，方可使用。,Company Logo,二、试验物品准备,在选取培养基时，放于眼前细致观察（包括PH值，装量是否一致、试管有无裂痕） 因培养基在搬运过程中，容易造成个别试管胶栓松动，从而影响PH值的细微变化。 如不细致察看，在试验中会存有很大的隐患，影响结果的判定。,Company Logo,二

3、、试验物品准备：,2、灭菌物品的确认： 高压根据试验要求，准备所需器材和物品。需在灭菌物品盒标注名称，并填写灭菌日期，清点无误后将其送至灭菌前间。 灭菌是无菌物品生产的重要环节，根据物品的性能选择合适的灭菌方式，是确保试验质量的关键。 我们通常把玻璃器皿包括吸管瓶子选择1802小时干热灭菌，胶栓12160分钟灭菌，取回灭菌物品时，一定要在有效期内使用，试验前确认指示剂是否合格及包装的完整性，干燥性，合格后方可使用。,Company Logo,二、试验物品准备：,物品摆放整齐的准备间：,Company Logo,二、试验物品准备：,工作人员在控制高压温度：,Company Logo,三、无菌操作

4、要求及注意事项,环境,操作,人员,三大要素,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,环境： 1.无菌操作应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 2.工作台面及操作室环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的进行洁净度验证。,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,3.无菌操作室每天都要用0.1%的新洁尔灭或来苏水清洁剂，清洁次(抹布要专用).紫外线照射消毒30-50min； 超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面

5、消毒时切勿将供试品和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡紫外线，降低消毒效果。,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,人员： 无菌试验操作进入万级操作间时，操作人员必须着装整齐，穿好已灭菌的三更服装。 需带两层口罩，一层是白纱布，最后一层随三更服已灭菌的口罩。 方可进入无菌室进行操作 。,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,操作,即便使用设备完善的实验室。 技术操作不规范,也会导致污染.,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,在操作中为最大可能的保证无菌。 每一项工作都必须做到有条不紊。,Company L

6、ogo,三、无菌操作要求及注意事项,操作 1.在开试验前要制定好实验计划和操作程序。 有关数据的计算要事先做好。 准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。 这可以避免开始实验后，因物品不全，往返拿取而增加污染机会。,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,2.在无菌环境进行试验时，操作人员要确定好自己所工作的位置，操作前戴手套，酒精棉进行消毒。 3.点燃煤气灯后。用火焰先把试管架上的培养基胶栓与试管口处烧灼一下，以后一切操作，如打开或封闭瓶口时，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 但要注意：金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要

7、待冷却后方可使用。,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,4.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养基中。 开启、关闭供试品时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高灭活供试品。 另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害供试品。 5.进行试验时，吸管抽取供试品后，要与培养基试管平行且垂直，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。,Company Logo,三、无菌操作要求及注意事项,6.吸取营养液、 氯化钠等及各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致交叉污染。手或拿取物品

8、时不能经过打开的瓶口上方，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管废弃。 7.不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。工作由始至终要保持一定顺序性。供试品在未使用之前，用煤气灯先把试管架上的培养基胶栓及试管口处烧灼一下，勿过早暴露在空气中。同样，培养基在未用前，不要过早开栓 用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口，直立可增加落菌机会。,Company Logo,四、具体检测方法,检测方法,支原体检测,无菌试验,Company Logo,四、具体检测方法,硫乙醇酸盐流体培养基 用于培养需氧菌/厌氧菌,改良马丁培养基 用于培养真菌,营养琼脂培养基 用于培养需氧菌,无菌试验培养基,

9、Company Logo,四、具体检测方法,无菌试验样品取样标准： 1.原液及半成品： 抽检量应至少为0.1%，但不得少于10ml，如原液及半成品除菌过滤后，分别于多个容器内，则每个容器抽检量不得少于10ml，原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽检。,Company Logo,四、具体检测方法,无菌试验样品取样标准： 2.成品： 每亚批均应进行无菌检查，供试品应随时抽取，包括分装过程中的前、中、后抽样。 分装量在100支（瓶）或100支（瓶）以下者抽验量不少于5支。 101-500支（瓶）者抽验量不少于10支（瓶）。 500支（瓶）以上者抽验量不少于20支（瓶）。,Company Logo,四、

10、具体检测方法,无菌试验检测方法,直接法,增菌法,薄膜过滤法,Company Logo,四、具体检测方法,增菌法： 含防腐剂的供试品，应先增菌培养. 按种量与培养基的比例： 用苯酚或三氯甲烷作防腐剂者至少为1:20， 用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛，抗生素者至少为1:50. 将混合供试品先按此比例接种于硫乙醇酸盐流体培养基（不得少于200ml）内增菌，于20-25培养3天后移种至硫乙醇酸盐流体培养基，营养琼脂斜面，改良马丁培养基各2管，每管10ml，培养基接种0.5ml。,Company Logo,四、具体检测方法,直接法: 不含防腐剂供试品，不需增菌培养. 按成品抽样量及抽验瓶数的要求将每批（

11、或亚批）抽检的供试品逐瓶（支）取样混合: 装量在5.0ml或5.0ml以下者每10瓶（安装）混合，装量在5.0ml以上者，每7瓶（安装）混合， 应接种培养基管数依供试品混合总量而定。 混合后的供试品接种量按不超过培养基体积10%（ml/ml）直接接种于硫乙醇盐酸流体培养基，营养琼脂斜面及改良马丁培养基，三种培养基接种支数之比为1：1：1。,Company Logo,四、具体检测方法,薄膜过滤法: 采用全封闭式薄膜过滤器，薄膜孔径不大于0.45um，膜直径约47mm. 取规定抽验供试品数，（如供试品少于10ml，则先加入100ml0.9%,无菌氯化钠溶液或适宜的无菌溶剂），立即在无菌条件下导入无

12、菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。 含汞类等防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml，过滤后，两个滤器中加硫乙醇盐流体培养基各100ml，另一个滤器加改良马丁培养基100ml。,Company Logo,四、具体检测方法,Company Logo,四、具体检测方法,无菌试验结果判定： 对每一试管逐一进行验证，PH是否有变化有无菌落生长，应完全透明无沉淀。 1.硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基均为澄清，营养琼脂斜面未见菌生长，判供式品符合规定。 2.如硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂斜面中任何一管有菌生长，并证明生长

13、的微生物为供试品含有，判定供式品不符合规定。,Company Logo,四、具体检测方法,当满足下列至少一个条件时，判实验结果无效： 对无菌检查相关设施的微生物监控数据表明其不符合其规定； 对无菌检查过程的回顾，揭示了本操作程序是错误的； 阴性对照管有菌生长； 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌检查中使用的物品和无菌操作技术不当引起的；,Company Logo,四、具体检测方法,供试品复检 无菌试验如经确认无效，应重试。 重试时，重新取同量供试品，依法重试， 如无菌生长，判供试品符合规定 ， 如有菌生长，判供试品不符合规定。,Company Logo,四、具体检测方法,支

14、原体： 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径02um)并独立生活的微生物 . 多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH76-80)，对酸耐受性差。 对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。,Company Logo,四、具体检测方法,细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。 在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，国内外研究表明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。,Company Logo,四、具体检测方法,95以上 是以下四种支原体,口腔支原体,精氨酸支原体,猪鼻支原体,莱氏无胆甾原体 为牛源性,C

15、ompany Logo,四、具体检测方法,支原体检测： 支原体因病毒类疫苗类中所用的牛血清可能被感染支原体，所以生产所收获病毒收获液都要做支原体检测。 使用培养基为流体和半流体培养基。,Company Logo,四、具体检测方法,实验器材的污染,支原体 污染源,Company Logo,四、具体检测方法,图为GHK细胞,当支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉。 实则细胞受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，抑制细胞生长等。 最为致命的是，即使存在很严 重的支原体污染，细胞外观可无明显变化。如果继续使用这种已被支原体污染

16、，而貌似正常的细胞做实验，将会严重影响实验结果。,Company Logo,四、具体检测方法,支原体检测步骤： 供试品如在分装后，24小时以内进行支原体检查可储存于2-8，超过24小时应置-20以下储存。 支原体半流体培养基使用前煮沸10-15分钟，冷却至56左右备用。 支原体半流体培养基与支原体肉汤培养基加入灭能小牛血清（培养基：血清为8：2）,Company Logo,四、具体检测方法,支原体半流体培养基（4支）,支原体肉汤培养基（4支）,第7天，取2支,第7天，取2支,一支,一支,一支,一支,半流体2支,肉汤2支,半流体2支,肉汤2支,半流体2支,半流体2支,肉汤2支,肉汤2支,移种前剩

17、余培养基及移种后的培养基 分别培养21天，（361）。每隔3天观察一次,Company Logo,四、具体检测方法,一旦支原体污染： 一律废弃重新培养。 对于具有重要价值的细胞株， 有必要清除支原体的，常用方法有： 抗生素处理 抗血清处理： 抗生素加抗血清和补体联合处理,Company Logo,四、具体检测方法,支原体最突出的结构特征是没有细胞壁， 对作用于细胞壁生物合成的抗生素：如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感； 对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。 对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮； 其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。,Company Logo,四、具体检测