6+经典液相色.ppt

1、第10章 经典液相色谱法,1.定义：经典液相色谱法包括柱色谱和平面色谱，是在常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法。 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法,一、吸附色谱法,分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。 吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程 。,吸附系数与吸附剂的 活性、组分的性质和 流动相的性质有关。,吸附色谱法,固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。 硅胶表面硅醇基为吸附中心。 经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶 高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。 气相色

2、谱：高分子多孔微球等,三、吸附剂和展开剂的选择 （一）常用吸附剂多孔、微粒状物质 （1）硅胶 （2）氧化铝 （3）聚酰胺,1.硅胶 吸附活性：硅醇基,特性： （1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性，吸附能力 吸附活性次序：活泼型束缚型游离型 （2）吸水失活 105110OC烘干30分钟(可逆失水)吸附力增大 500OC烘干(不可逆失水)活性丧失，无吸附力 适用： 分析酸性或中性物质,2. 氧化铝 碱性氧化铝 pH 910 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 45 适于分析酸性、中性物质 3. 聚酰胺 氢键作用 氢键能力，吸附能

3、力,（二）吸附剂和展开剂的选择： 依据被测组分、吸附剂和展开剂的性质 （1） 被测组分性质（极性大小）： 烃 - - - - - - - - 羧酸，醇 （2） 吸附剂的活性： 吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力强 强极性物质选择弱吸附剂 弱极性物质选择强吸附剂 （3）展开剂的极性： 展开剂极性大，对被测组分的洗脱能力大 “相似相溶”原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的展开剂。,组分 吸附剂 展开剂 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性 极性 活性小 极性,（三） 三者关系：,吸附色谱法,流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂） 洗脱能力：主要由其极性决定。 强极性流动相占据吸附中心的能

4、力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。 Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。,一些溶剂在硅胶上的o值,吸附色谱法,洗脱顺序 ka=KaSa/Vm 在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。 Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。,二、分配色谱法,分配色谱法,分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。,溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相 中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流 动相的性质 (种类与极性) 有关；在GL

5、C中K与 固定相极性和柱温有关。,分配色谱法,固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层 液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机 基团键合到载体上形成的固定相）。 流动相 气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。 正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。 反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。,分配色谱法,洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。,正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。 （库仑力和氢键力）,反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。,载体： 对载体的要求：化学惰性；对组分的吸附力小，但能吸留较大量的

6、固定相液体。载体必须纯净，颗粒大小。 常用载体：硅胶、硅藻土、纤维素。,三、离子交换色谱法,分离原理 利用被分离组分离子交换能力的 差别而实现分离。 分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。 阳离子交换： 阴离子交换： 离子交换通式：,交换,再生,+,+,3,RNR+,OH-,Cl,RNR+,3,Cl,OH,交换,再生,+,+,RSO,H+,Na+,Na+,+,3,3,H,RSO,与固定相（离子交换树脂）亲和力弱的组分在固定相上保留时间短，先流出色谱柱，与固定相（离子交换树脂）亲和力强的组分在固定相上保留时间长，后流出色谱柱。,四、空间排阻色谱法,分离原理根据被分离组分分子的线团尺寸 进行分离

7、。 也称为分子排阻色谱法。,分子量大的组分不能进入固定相内部，行走的路径短，先流出色谱柱，分子量小的组分可以进入固定相孔径深处，行走的路径长，保留时间长，后流出色谱柱。,空间排阻色谱法,固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质 主要性能参数 平均孔径 排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。,空间排阻色谱法,流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低 水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gel filtration chromatography； GFC)；

8、 非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶渗透色谱gel permeation chromatography；GPC)。,空间排阻色谱法,保留体积与渗透系数的关系,VmV0,分子线团尺寸（分子量）大的组分， 其渗透系数小，保留体积也小， 因而先被洗脱出柱。,小结,色谱过程方程式： 分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。 K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp， Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。,一、概

9、述 二、定性参数 三、薄层板的制备和薄层色谱的操作方法 四、定性与定量分析,薄层色谱法 （Thin LayerChromatography,TLC）,一、概述,1、定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法。 2、操作过程： 铺板 活化 点样 展开 斑点定位 3、分离机制：吸附(分配，离子交换，空间排阻)。 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的 吸附能力差异而实现分离 4、特点：分析快速、灵敏、显色方便 5、应用：成分鉴别、杂质检查、定量分析,二、定性参数,1、 比移值Rf,L2,L1,L0,设R为单位时间内一个分

10、子在展开剂中出现的几率，可以导出：,讨 论 （1） Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关， （2）色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，对于极性组分 展开剂极性大，Rf大（容易洗脱） 展开剂极性小，Rf小 （不容易洗脱） （3）Rf范围：0 Rf 1 Rf = 0.20.8（常用） 0.3 0.5（最佳）,2、 相对比移值Rs,讨论 参考物与被测组分在完全相同条件下展开，可以消除系统误差，可以提高结果重现性和可靠性 参考物可以是后加入的纯物质，也可以是样品中已知组分 相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于1。,三、薄

11、层板的制备和薄层色谱的操作方法,硅胶G含粘和剂 硅胶H不含粘和剂，铺板时另加入CMC-Na 硅胶GF254含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 薄层板的制备: 手工制板，预制板 操作方法：板的活化 点样：点样量 点样面积 展开：上行展开，展开槽预饱和 斑点定位：显色 荧光检测 荧光物质（普通硅胶板上显亮斑） 非荧光有紫外吸收的物质（硅胶GF254板上显暗斑）,四、定性与定量分析 1.定性：将样品与标准品在相同条件下展开，比较Rf值的一致性，用于有范围的组分定性。 2.定量： （1）洗脱定量：将样品斑点收集起来，经过萃取，再用合适方法定量，如用分光光度法、电化学法。该法特点：操作繁杂。 （2）薄层

12、扫描法（TLCS）：是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有吸收紫外或可见光的斑点、或经激发后能发射荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的数据用于含量测定的方法。,TLCS测定原理： （1）吸收测定法适用于在可见和紫外范围有吸收的组分。 （2）荧光测定法适用于可发射荧光的组分。 TLCS测定方法： （1）反射法将光束照射到薄层斑点上，通过测量反射光的强度对组分进行定量。 （2）透射法通过测量透射光的强度，对组分进行定量。 在实际应用中，多采用反射法，因为反射法受薄层板厚度影响小，基线稳定，有较大的信噪比。,TLCS扫描方式：（1）线性扫描：用一束比斑点略长的光作单向扫描；扫描速度快，但斑点形状不

13、规则和浓度不均匀时误差较大。 （2）锯齿扫描：用一微小的光束同时在互相垂直的两个方向上进行锯齿状扫描；由于光束微小（1.25mm1.25mm）,受斑点形状和浓度分布的影响较小。,TLCS定量方法： （1）外标法（工作曲线法） 定量依据：CF1AF2 C：组分的质量或浓度 A：组分斑点面积的积分值 （2） 内标法 选择一个与所测组分能很好分离的物质，将其加到标准和样品溶液中，以色谱峰面积的比值定量。,TLCS的误差从某种程度上讲主要取决于薄层板的制备，以及点样、展开、显色等过程。,纸色谱法（Paper Chromatography,PC）,定义：将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、进行定性和定量的液-液分配色谱法。,固定相：纸纤维吸附的水 流动相：与水不互溶的有机溶剂（如饱和正丁醇） 分离机制：液-液分配色谱 定性参数：,讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有