中国农科院分子遗传学知识点整理综合

1、中国农科院分子遗传学知识点整理综合2013 分子遗传学复习（综合版）一、名词解释1、结构基因（Structural gene）： 负责编码细胞代谢途径中组成型蛋白质的基因。是决定合成某一种蛋白质分子结构相应的一段 DNA。结构基因的功能是把携带的遗传信息转录给 mRNA（信使核糖核酸），再以 mRNA 为模板合成具有特定氨基酸序列的蛋白质。2、调节基因（Regulatory gene）： 是调节蛋白质合成的基因。它能使结构基因在需要某种酶时就合成某种酶 ，不需要时，则停止合成，它对不同染色体上的结构基因有调节作用。3、基因组（genome）： 生物所携带的遗传信息的总和 ，在真核生物中单倍体细

2、胞所包含的整套染色体；或是指一个物种的单倍体染色体所含有的一整套基因；或是指整套染色体所包含的 DNA 分子以及 DNA 分子所携带的全部遗传指令。4、C 值悖理（C-value paradox）： 生物基因组的大小同生物在进化上所处地位的高低无关，这种现象称为 C 值悖理。N 值悖理（ N-value paradox）： 基因数目与进化程度或生物复杂性的不对应性，称之为N 值悖理。5、基因家族（gene family）： 基因组中存在的许多来源于同一个祖先，结构和功能相似一组基因。同一家族的这些基因的外显子具有相关性，可在基因组内集中或分散分布。6、孤独基因（orphon）： 在成簇的基因家

3、族中通过染色体重排而分散到其他位置上的成员，被称为孤独基因（ orphan gene）。7、假基因（pseudogene）：核苷酸序列与相应的正常功能基因基本相同，但由于突变积累丧失编码蛋白质能力的基因或不产生有功能产物的基因称为假基因。8、卫星 DNA（Satellite DNA）： 真核细胞染色体具有的高度重复核苷酸序列的 DNA。总量可占全部 DNA 的 10%以上，主要存在于染色体的着丝粒区域，通常不被转录。因其碱基组成中 GC 含量少，具有不同的浮力密度，在氯化铯密度梯度离心后 在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带而得名 。小卫星 DNA（Minisatellite DNA）： 真

4、核基因组中由大约 25 bp 的 DNA 序列头-尾串联重复组成的重复 DNA 片段，造成可变数量随机重复型的多态性，大小为 130kb。微卫星 DNA （Microsatellite DNA）： 一种简单串联重复 DNA 序列。其重复单位为16 个核苷酸，由 1050 个重复单位串联组成。在整个基因组中分布广且密度高。虽然其功能尚不清楚，但在遗传图和物理图的研究中是非常有用的工具。隐蔽卫星 DNA（cryptic satellite DNA）： 用密度梯度离心分不出一条卫星带，但仍存在于 DNA 主带中的高度重复序列。STR(短串联重复序列) 又称为微卫星 DNA，重复单位为 2-6bp，个

5、体间由于重复次数的差异而表现出多态性，且符合孟德尔遗传定律，是目前的广泛使用的一种分子标记。9、DNA 指纹（DNA fingerprints）： 具有完全个体特异的 dna 多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，因而得名。可用来进行个体识别及亲缘关系鉴定.10、超基因（super gene）：指真核生物基因组中紧密连锁的若干基因座，作用于统一性状或一系列相关性状。超基因家族 （supergene family）： DNA 序列相似，但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族的总称。11、单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP）：

6、是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入 。12、遗传标记（Genetic marker）： 遗传标记是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。可示踪染色体、染色体片段、基因等传递轨迹的一种遗传特性 。13、重叠群（Contig）： 依片段 DNA 克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做 “克隆重叠群 ”。14、位点（site）： 基因组内具有一定功能 （如突变、重组及与其他分子相互作用等 ）的一个或若干个核苷酸突变的位置。15、单体型（haplotype）： 一条染色体特定

7、区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合 。16、错义突变（missense mutation）： 是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后 ，变成编码另一种氨基酸的密码子 ，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变17、无义突变（nonsense mutation）： 由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。18、中性突变（neutral mutation）：中性突变是一种不会直接导致物种短期内发生明显变异的突变，经自然选择保留下来，再经隔离形成新物种，生物进化主要由中性突变决定。19、沉默突变（silent mutation，

8、or 同义突变 synonymous mutation）： 由于生物的遗传密码子存在简并现象，在某一碱基改变后，在原来的某种 aa 的位置译成同一种 aa，此现象称同义突变。20、移码突变（frame shift mutation ）： 在正常地 DNA 分子中，碱基缺失或增加非 3的倍数，造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。21、回复突变（reverse mutation）： 突变体（ mutant）经过第二次突变又完全地或部分地恢复为原来的基因型和表现型 。完全恢复是由于突变的碱基顺序经第二次突变后又变为原来的碱基顺序。22、动态突变（dynamic muta

9、tion）： 基因组内一些简单串联重复序列的拷贝数在每次减数分裂或体细胞有丝分裂过程中 发生扩增而导致的突变 。23、表观遗传变异 （epigenetic variation）： 基因的核苷酸序列不发生改变的情况下， 但由于基因的修饰如 DNA 甲基化、组蛋白的乙酰化等导致基因的活性发生了改变，使基因决定的表型出现变化，且可传递少数世代，但这种变化是可逆的。表观遗传现象/修饰有哪些？其生物学功能如何？请举其中两例加以说明。答： 表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有X染色体剂量补偿， DNA 甲基化（DNAm

10、ethylation），基因组印记（ genomicimpriting），母体效应（ maternaleffects），基因沉默（ genesilencing），组蛋白密码， 核仁显性，休眠转座子激活和RNA 编辑（ RNA editing）等。X 染色体失活在哺乳动物中,雌雄性个体 X 染色体的数目不同 ,这类动物需要以一种方式来解决 X 染色体剂量的差异。在雌性哺乳动物中 ,两条 X 染色体有一个是失活的 ,称为 X 染色体的剂量补偿（ dosage compensation） 。X 染色体失活的选择和起始发生在胚胎发育的早期 , 这个过程被 X 失活中心（ X - inactivatio

11、n center ,Xic） 所控制,是一种反义转录调控模式。这个失活中心存在着 X 染色体失活特异性转录基因 Xist （X - inactive - specifictranscript） ,当失活的命令下达时 ,这个基因就会产生一个 17kb 不翻译的 RNA与 X 染色体结合,引发失活。 X 染色体的失活状态需要表观遗传修饰如 DNA 甲基化来维持。这种失活可以通过有丝或减数分裂遗传给后代。DNA 甲基化甲基化是基因组 DNA 的一种主要表观遗传修饰形式 ,是调节基因组功能的重要手段。在脊椎动物中,CpG 二核苷酸是 DNA 甲基化发生的主要位点。 CpG 常成簇存在,人们将基因组中富

12、含 CpG 的一段 DNA 称为 CpG 岛（ CpGisland） 。CpG 岛常位于转录调控区附近 ,DNA 甲基化的研究与 CpG 岛的研究密不可分。在细胞分化的过程中 ,基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。但在哺乳动物的生殖细胞发育时期和植入前胚胎期 ,其基因组范围内的甲基化模式通过大规模的去甲基化和接下来的再甲基化过程发生重编程 ,从而产生具有发育潜能的细胞。组蛋白密码染色体的多级折叠过程中 ,需要 DNA 同组蛋白（ H3、H4、H2A、H2B 和 H1） 结合在一起。研究中,人们发现组蛋白在进化中是保守的 ,但它们并不是通常认为的静态结构。组蛋白在翻译后的修饰中会发生改变 ,从而提

13、供一种识别的标志 ,为其它蛋白与 DNA 的结合产生协同或拮抗效应,它是一种动态转录调控成分 ,称为组蛋白密码（ histonecode）。这种常见的组蛋白外在修饰作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP 核糖基化、羰基化等等,它们都是组蛋白密码的基本元素。基因组印记人们在研究中发现 ,来自双亲的某些等位基因 ,在子代的表达不同 ,有些只有父源的基因有转录活性,而母源的同一基因则始终处于沉默状态 ,另一些基因的情况则相反。这是由于源自某一亲本的等位基因或它所在染色体发生了表观遗传修饰 ,导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。在基因组中的这类现象就是基因组印记（gen

14、omicimprinting）。24、启动子的作用是什么？原核生物启动子结构特征是什么？启动子(promoter)：与基因表达启动相关的顺式作用元件，能与 RNA 聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域,包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。它是一段位于起始位点 5端上游区具有独立功能的 DNA 序列，能活化 RNA 聚合酶，使之与模板 DNA 准确相结合并具有转录起始的特异性。原核生物的启动子：在操纵元中，从 mRNA 开始转录的位点以上都是启动子序列， 20bp-200bp。特点：1.Pribnow 框：TATAAT，位于-10 左右，是 RNA 聚合酶的牢固结合位点；2.Sextama 框

15、：TTGACA，位于-35 附近，是 RNA 聚合酶的初始结合位点；3. 上述二者及之间的距离决定转录效率，一般距离 17bp 左右；4. CAP 位点 cAMP-受体蛋白复合物在启动子上的的结合位点。26、转录单元（Transcription unit）： 转录单元是一段以启动子开始至终止子结束的DNA 序列。27、顺式作用元件 （cis-actingelement）： 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质 ，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。2

16、8、反式作用因子 ：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。反式因子的主要特点：（1）一般具有三个功能结构域：DNA 识别结合域、转录活性域、结合其它蛋白的结合域。这些功能区含有几十到几百个氨基酸残基（2）能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件。（3）对基因表达有正性和负性调控作用，即渡海和阻遏基因的表达。反式作用因子类型和特点与转录水平调节相关的反式作用因子通常可分为四大类： RNA 聚合酶；和 RNA 聚合酶相联系的普遍性转录因子,它们结合在靶基因的启动子上，形成前起始复合物，启动基因的转录；特异性转录因子(如激活因子和抑制因子) ，是一类

17、与靶基因启动子和增强子(或沉默子)特异结合的转录因子，具有细胞及基因特异性，可以增强或抑制靶基因的转录；种类多样的协调因子，要么改变局部染色质的构象(如组蛋白酰基转移酶和甲基转移酶)，对基因转录的起始具有推动作用，要么直接在转录因子和前起始复合物之间发挥桥梁作用(如中介因子)，推动前起始复合物形成和发挥作用。简述真核生物转录因子的三种 DNA 结构域？转录因子一种具有特殊结构的蛋白质因子，与基因 5端上游特定序列专一性结合 ,与真核生物 RNA 聚合酶共同作用完成转录的过程, 从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达。真核生物的转录因子分为通用型和基因特异型。从结构来看，转录因子主要

18、有 DNA 结合域和活性域两大功能区，DNA 结合域根据氨基酸结构的特点，可分为：1）HTH 和 HLH 结构：由两段-螺旋夹一段 -折叠构成，-螺旋与 -折叠之间通过 -转角或成环连接，即螺旋-转角- 螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。2）锌指结构：由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 Zn2+，可以自我折叠形成 “手指”结构，根据其保守结构域的不同可分为 C2H2 型、C4 型和 C6 型。3）亮氨酸拉链结构(ZIP)：由两段 -螺旋平行排列构成，螺旋肽链中每个重复片段的第七个氨基酸残基均为亮氨酸 ，亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状。29、绝缘子（insulat

19、or）： 一种顺式作用元件。长约数百个核苷酸对，通常位于启动子正调控元件或负调控元件之间的一种调控序列 。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。30、沉默子（silencer）： 帮助降低或关闭邻近基因表达活性的一段 DNA 顺式元件序列。31、应答元件（response element）： 基因控制区的一个短的片段。另一个基因的蛋白质产物可以与之相互作用，在结构上相当于 DNA 结合位点。位于启动子或增强子序列中对特定因子做出反应的元件 。31、顺式剪接（cis-splicing）： 将一个信使核糖核酸（ mRNA）前

20、体中的各个内含子切除，并将相互邻近的各个外显子加以连接，形成成熟的 mRNA 的过程。在这个过程中，各个外显子都来自同一个 mRNA 分子。32、蛋白质组（proteome）： 在一定条件下，存在于一个体系（包括细胞、亚细胞器、体液等）中的所有蛋白质。33、蛋白质组学 （proteomics）： 阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式 ）、结构、功能和相互作用等 。基因组学(genomics) 它是研究基因组的组成、结构和功能的学科。它分为结构基因组学和功能基因组学。前者是研究基因组的结构并构建高分辨率的遗传图、物理

21、图、序列图和转录图以及研究蛋白质组成与结构的学科；后者主要是利用结构基因组学研究所得到的各种信息在基因组水平上研究编码序列及非编码序列生物学功能的学科。蛋白质组与基因组的特点比较。蛋白质组（ proteome）：在整个基因组中所表达的全部蛋白质的集合，因为对于有些基因，它的一条基因就能表达多种蛋白质，所以蛋白质组的数量远大于基因组的基因数量。有时，这个词也描写在任何时候，一个细胞所表达的全部互补的蛋白质。基因组（ genome）：生物体遗传物质的全部序列，它包括每一条染色体和任何亚细胞器的 DNA 的序列。34、切口平移法 （nick translation）： 当双链 DNA 分子的一条链上

22、产生切口时 ，E.coliDNA 聚合酶就可将核苷酸连接到切口的 3羟基末端。同时该酶具有从 53的核酸外切酶活性，能从切口的 5端除去核苷酸。35、随机引物标记法 （random primer labeling）： 在克列诺（ Klenow）酶催化下利用随机引物引导放射性或荧光等标记的脱氧核苷三磷酸（ dNTP）参入合成 DNA 新链的一种能够得到高比度标记的 DNA 探针的方法。36、核酸分子杂交 （uncleic acid hybridization）： 存在互补序列的不同来源的核酸分子，以碱基配对方式相互结合形成 DNA-DNA 或 DNA-RNA 杂交体的过程。37、Southern

23、 Blotting：一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的 DNA 片段，将胶上的 DNA 变性并在原位将单链 DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或 者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定 DNA 分子的含量。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。常用的 Southern 转膜方法:（）毛细管虹吸印迹法：（）电转印法（）真空转移法38、染色体原位杂交 （chromosome hybridization in situ）： 染色体原位杂交（chrom

24、osome in situ hybridization）技术使用染色体特异性的 DNA 探针，可以检测非分裂期即间期细胞核的染色体的数量及结构异常，因而也称为间期细胞遗传学。39、基因组比较原位杂交 （Comparative genome in sifu hybridization）/比较基因组杂交（ Comparativegenomehybridization，CGH）： 基因组原位杂交（ Genomicin situ hybridization GISH）技术是分析异源多倍体基因组组成、起源、演化以及基因组间亲缘关系的一种有效的手段。这一技术是 80 年代末 90 年代初发展起来的，它利用

25、一个物种的基因组总 DNA 作为标记探针，对另一物种的染色体上进行原位杂交，由此来探测这两个物种间的亲缘关系。用这一方法，可准确评价各基因组的亲缘关系，快速而可靠地研究各基因组的起源与进化。40、染色体描绘技术 （Chromosome Painting）： 将整条染色体、某条染色体臂 (长臂或短臂) 或者染色体某个片断的 DNA 制备成探针, 然后用荧光标记原位杂交的方法 , 将探针杂交到中期分裂相染色体上 , 在荧光显微镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色 , 从而分析和研究染色体的重组和畸变。41、核酸原位杂交 （nucleic acid hybridization in situ）：利用一

26、段顺序的单链 DNA或 RNA 作探针，与解链的染色体上的 DNA 单链进行原位杂交，确定 DNA 或 RNA 所在位置。原位杂交；核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称 核酸原位杂交步骤：（）组织或细胞的固定（）组织细胞杂交前的预处理（）探针的选择和标记（）杂交（）杂交结果检测。41、cDNA 文库：以 mRNA 为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成 cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增， 这样包含着细胞全部 mRNA 信息的 cDNA 克隆集合称为该组织细

27、胞的 cDNA 文库。42、cDNA 末端的快速扩增 （rapid amplification of cDNA ends， RACE）： 一种应用特异引物和公用引物从低丰度转录本中快速扩增已经 cDNA 片段旁侧 5和 3末端的简单而有效的方法。它是由 PCR 技术发展而来，也称为锚定 PCR。它是利用 Oligo(dT)对 mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头（引物） ，从而可利用基因特异的引物通过 PCR 反应快速获得目的序列的 5端和 3端。43、splicesome：剪接体，由核小 RNA（snRNA，U1、U2、U4、U5、U6 等）和蛋白质因子（约 100 多种）动态组成、

28、识别 RNA 前体的剪接位点并催化剪接反应的核糖核蛋白复合体。44、smallnuclear RNAs，snRNAs：细胞内有小核 RNA，它是真核生物转录后加工过程中RNA 剪接体（ spilceosome）的主要成分，参与 mRNA 前体的加工过程。45、small cytoplasmic RNAs，scRNA：胞质小 RNA，真核细胞有细胞核和细胞浆中都含有许多小 RNA，它们约有 100 到 300 个碱基，每个细胞中可含有 105-106 个这种 RNA 分子。它们是由 RNA 聚合酶或所合成的，其中某些像 mRNA 一样可被加帽。在细胞核中的小RNA 称为 snRNA，而在细胞浆中

29、的称为 scRNA。但在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为 snRNP 和 scRNP。46、internal guide sequenece，IGS：内部引导序列由 6 个核苷酸组成 GGAGGG（四膜虫）。位于内含子中可与外显子配对的序列，作用是决定剪接的专一性。 （I 类内含子中）。47、trans-splicing（反式剪接 ）： 把分别位于不同前体 mRNA 中的外显子切下来而后拼接为成熟 mRNA。48、spliced leader RNA，SL RNA：反式剪接引导序列 ，在反式剪接反应的剪接体上，U1-snRNA 会被所谓的反式剪接引导序列 “Spliced-Leade

30、r”（SL）snRNA 替换，和 U1snRNA 不同，SL RNA 会在剪接过程中被消耗，其 5端有一外显子，它会和一段多顺反子的抄本中的外显子组成成熟 mRNA。SL RNA 的外显子含有 ATG-启动子，它是完整 mRNA 拥有正确的开放阅读框（ open reading frame）的前提。49、Protein splicing：蛋白质剪接，一种在蛋白质水平上翻译后的加工过程 ,它由一系50、Extein and Intein：蛋白质外显子 ，某些蛋白质前体中经自我剪接后保存下来的一些肽段。其重新连接成为成熟的蛋白质，与被切除的内含肽相对应 。蛋白质内含子（ protein intro

31、n）：存在于某些蛋白质前体肽链内部的一些肽段。在转变为成熟蛋白质时，通过非酶促的转肽反应被切除，与其对应的是保留于成熟蛋白质中的外显肽。这些肽段具有核酸酶活性。列分子内的剪切一连接反应组成。 蛋白质前体通过自我剪接去除 intein、连接 extein 的过程。蛋白质剪接是蛋白质内含肽介导的 ,它可以催化自身从蛋白质前体中断裂 ,使两侧的蛋白质外显肽连接成成熟的蛋白质 。51、intein homing：内含肽归巢 ，含有内切核酸酶活性的内含肽，可介导其编码序列的基因进行特异的移位，使其整合到不含有内含肽的同源物中 。52、enhancer：增强子，增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在

32、相对于启动子的任何方向和任何位置（上游或下游 ）上都发挥作用54、specific transcription factor：组织细胞特异性转录因子 ，这此 TF 是在特异的组 织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时， 才需要的一类转录因子。55、enhancosome：增强体， 转录因子与增强子装配形成的具有高度三维空间结构的复合物 ，可使 DNA 形成弯曲的空间构象，从而提高基因转录的效率。56、RNA interference，RNAi：RNA 干扰，是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性 mRNA 同源的双链 RN

33、A 时，该 mRNA 发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。外源 dsRNA 进入细胞后产生的小分子干扰 RNA 的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物，RISC 具有结合和切割 mRNA 的作用而介导 RNA 干扰的过程。RNAi 具有特异性和高效性。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。micRNA（mRNA-interfering complementary RNA）：干扰 mRNA 的互补 RNA，是指能与被调控的RNA 互补的小分子 RNA，通过碱基的互补配对与目标 mRNA 或 DN

34、A 形成双链复合物，影响 RNA 的修饰、翻译、转录等过程，封闭或抑制基因的正常表达 。基因沉默、RNA 干扰以及其作用基因沉默（Gene Silencing) 基因沉默是指外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象，它是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。 基因沉默发生在两种水平上，一种是由于 DNA 甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标 RNA 进行特异性降解而使基因失活。RNA 干涉(RNAi)是正常生物体内一些小的双链 RNA，可有效地阻断靶基因表达的现象。当向细胞中导入与

35、内源性 mRNA 同源的双链 RNA(dsRNA)小分子时，可以通过促使该 mRNA 降解，从而高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致基因表达沉默的现象。对 RNA 干涉机制的研究，特别是对其特异性和高效性的影响因素的探讨，必将称为基因功能研究的一把利器，也是基因表达调 控、基因治疗的一种重要手段。RNAi 的作用机制及其在实际中的应用？答： RNAi 的作用机制如下：siRNA 的形成阶段：此阶段需要 Rde-1,Rde-4 和 dsRNA 特异性的核酸内切酶 Dicer等共同参与。 Rde-1,4 编码的蛋白识别外源 dsRNA，引导 dsRNA 与 Dicer 结合，然后，Dicer

36、将 dsRNA 解旋，再将其裂解为 21-25 nt 大小的小干扰 RNA（small interferingRNA，siRNA）。 RNA 诱导的沉默复合物（ RNA-induced silicencing complex，RISC）形成阶段： 生成的 siRNA 和 RNAi 特异性酶如 AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ 蛋白和 DNA-RNA 螺旋酶结合形成 RISC，具有序列特异性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA 同源的靶 mRNA。效应阶段： siRNA 引导 RISC 与同源性的 mRNA 结合，在 ATP 及解旋酶（如 qde- 3，mut-

37、6，mut-14）的作用下使 siRNA 链解离，并使 RISC 由 250kD 大小的前体形式变成约 100kD 左右活性形式，同时解旋酶催化同源 mRNA 与 siRNA 的正义链相互交换，核酸酶在mRNA 与反义 siRNA 所形成的双链区的 5起始端下游 7-10 个核苷酸处切断 mRNA，起到特异的抑制基因表达的效果。扩增阶段：该反应以 siRNA 中的一条链为引物，以靶 mRNA 为摸板，在 RNA 依赖的RNA 聚合酶（ RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下，扩增靶 mRNA，产生新的二级 siRNA，而这些 siRNA 又能继续反作用于靶

38、mRNA。RNAi 在实际中的应用： 1.基因功能分析。利用 RNAi 技术敲除某一基因，研究此基因的功能。2 .RNAi 还可以作为寻找新的药物靶标的工具，可以高通量地发现药物靶基因，帮助新药物的研究和开发，了解药物作用的生化模式等。 3. 基因治疗, RNAi 只抑制致病基因，而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，能减少非特异作用引起的副作用。4. 研究信号传导通路的新途径 , 联合利用传统的缺失突变技术， RNAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系 .57、post-transcriptional gene silencing：转录后基因沉默

39、，PTGS 大量的转基因植株不能正常表达，通常这并不是由于转基因的缺失或突变引起的，而是基因失活的结果 。这种失活的现象称为基因沉默。部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的，称为转录后基因沉默。58、RNA-induced silencing complex ，RISC：RNA 诱导的沉默复合体， 由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶 mRNA 进行识别和切割。59、Small interfering RNAs ，siRNAs：是一种小 RNA 分子（21-25 核苷酸），由 Dicer（RNAase 家族中对双链 RNA 具有特异性的酶）加工而成。 SiRNA 能激发与之互补的

40、目标 mRNA 的沉默。60、replicon：复制子，作为含有一个复制起始点的独立复制单元的一个完整 DNA 分子或DNA 分子上的某段区域。质粒、细菌染色体和噬菌体等通常只有一个复制起始点，因而其DNA 分子就构成一个复制子；真核生物染色体有多个复制起始点，因而含有多个复制子。61、DNA replicase：DNA 聚合酶，以 DNA 为复制模板，从将 DNA 由 5端点开始复制到 3 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、 dNTP 等的情况下） 及其相辅的活性。62、replisome：复制体，复制体是指参与 DNA 复制的蛋白质复合物 ，其中至少

41、含有 DNA聚合酶及引发体（ primosome，引发酶与其他分子的复合物 ），SSB，解旋体等，复制体位于每个复制叉处进行细菌染色体 DNA 复制的聚合反应63、antisense RNA：反义 RNA，指与 mRNA 互补的 RNA 分子，也包括与其它 RNA 互补的RNA 分子。由于核糖体不能翻译双链的 RNA，所以反义 RNA 与 mRNA 特异性的互补结合 ，即抑制了该 mRNA 的翻译。反义 RNA 及其功能：反义 RNA 是单链 RNA，可与 mRNA 配对结合形成双链，最终抑制 mRNA 作为模板进行翻译。这是其主要调控功能，还可作为 DNA 复制的抑制因子，与引物 RNA 互

42、补结合抑制 DNA 的复制，以及在转录水平上与 mRNA 5末端互补，阻止 RNA 合成转录。反义 RNA 在基因治疗中的意义和需解决的问题及前景：通过反义 RNA 结合细胞中特异 mRNA 而调控其翻译，可望按剂量来调节特定基因的表达或功能。问题是：（1）专一性转移问题（2）反义 RNA 进入靶细胞前的降解问题。（3）受体介导反义RNA 转移技术。前景：（1）安全性高（2）反义 RNA 设计和制备方便（3）具有剂量调节效应（4）能直接作用于一些 RNA 病毒。64、rolling circle replication：滚环复制，某些双链环状 DNA 病毒复制的一种模型。按照这个模型，一条链首

43、先被核酸酶切开，然后由 DNA 聚合酶催化在 3端加上核苷酸单体，而此链的 5端则作为正在增长的自由尾部滚出，形成比原双链分子大的中间产物。随后合成与自由尾部互补的片段，最后再通过连接酶的作用连接在一起。65、anchoredPCR：锚式 PCR，用于扩增已知一端序列的目的 DNA。在未知序列一端加上一段多聚 dG 的尾巴，然后分别用多聚 dC 和已知的序列作为引物进行 PCR 扩增，锚定PCR（Anchored PCR，A-PCR）主要用于分析具有可变末端的 DNA 序列。66、asymmetric PCR：不对称 PCR，是用不等量的一对引物， PCR 扩增后产生大量的单链DNA（SSDN

44、A）。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001.在 PCR 反应的最初 1015 个循环中，其扩增产物主要是双链 DNA，但当限制性引物（低浓度引物）消耗完后，非限制性引物（高浓度引物 ）引导的 PCR 就会产生大量的单链 DNA。不对称 PCR 的关键是控制限制性引物的绝对量 ，主要用于制备 ssDNA。67、iverse PCR：反向 PCR， 反向 PCR 的目的在于扩增一段已知序列旁侧的 DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成 DNA。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA，然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子，通过反向

45、PCR 扩增引物的上游片段和下游片段 。68、multiplex PCR：多重 PCR，一般 PCR 仅应用一对引物，通过 PCR 扩增产生一个核酸片段。多重 PCR（multiplex PCR），又称多重引物 PCR 或复合 PCR，它是在同一 PCR 反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的 PCR 反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般 PCR 相同.69、reverse transcription PCR， RT-PCR：反转录 PCR，是聚合酶链式反应（ PCR）的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 P

46、CR 进行 DNA 扩增。70、fluorescent PCR：荧光定量 PCR，是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模版。73、QRTPCR：实时 PCR（real-time PCR），属于定量 PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内 DNA 的增幅量为基础进行 DNA 的定量分析。real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在 ds DNA 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅 DNA 序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（ probe）。rea

47、l time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的 RNA 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种 RT PCR 的组合又被称之为 “定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”。筑巢 PCR：先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为摸板扩增获取目的基因。可以提高 PCR 的效率和特异性。tail-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR），又叫巢式 PCR，是一种染色体步移技术。该技术通过 3 个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的 PCR 循环，利

48、用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。原位 PCR：以组织固定处理细胞内的 DNA 或 RNA 作为靶序列，进行 PCR 反应的过程。荧光定量 PCR 原理？如何 real-timePCR 检验干旱基因与表型关系？看图说明， X、Y 轴都代表什么意思？荧光定量 PCR 是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。原理：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基

49、团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时 ,探针结合在 DNA 任一一条单链上;PCR 扩增时， Taq 酶的5端 3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。进行荧光定量 PCR 检测时有，有两个图 :一个是扩增曲线，显示随着扩增反应循环数的增加扩增产物含量的荧光强度增加，其中X 轴代表的循环数， Y 轴代表荧光强度；一个是标准曲线，样品的浓度 log 值(X 轴)与其相对应的 Ct 值的关系(Y 轴， Ct 值是指产物

50、荧光强度首次超过设定阈值时， PCR 反应所需要的循环数 )。采用 real-timePCR 检验干旱基因与表型关系，可以设计如下实验：设置不同程度的干旱处理样品(4 个以上)及 1 个正常对照样品，每个样品 3 个平行重复。提取每个样品的 mRNA， 进行反转录并构建 cDNA 文库，采用 real-timePCR 检验干旱基因的表达水平，对比其样品的表型变化，建立干旱基因的表达水平与表型的相关性。说明 PCR 反应的基本原理并列举几种特殊的 PCR 方法答： 聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法，为最常用的

51、分子生物学技术之一。典型的PCR 由（ 1）高温变性模板；（ 2）引物与模板退火；（ 3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93-94） 使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（ Taq 酶）在 72将单核苷酸从引物的 3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成 DNA 的新互补链。PCR 引物设计的基本要求？答：1、引物长度一般为 1530 个核苷酸

52、。过短影响 PCR 的特异性，过长会提高相应退火温度， 使延伸温度超过 TaqDNA 聚合酶最适温度 74,影响产物的生成。2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3端不应有连续 3 个 G 和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C 含量一般占 45-55。3端和 5端引物具有相似的 Tm 值,Tm 值计算公式：Tm4(G+C)+ 2(A+T)3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免 3端的互补重叠。5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过 70，引物 3末端连续 8 个碱基在待扩增

53、区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物 3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板 DNA 配对。引物 3端最佳碱基选择是 G 和 C，形成的碱基配对比较稳定。7、引物与模板结合时，引物的 5端最多可以游离十几个碱基而不影响 PCR 反应的进行。8、引物的 5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。PCR 的反应条件？答：1、PCR 反应的缓冲液：l、Tris-HCl 缓冲液KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制 Taq DNA 聚合酶活性。加入 BSA 或明胶有利于保护 TaqDNA 聚合酶

54、活性。必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高 PCR 反应特异性。2、 镁离子浓度 一般用量 1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA 聚合酶活性需要 Mg 2+。Mg 2+浓度过低， 会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与 PCR 产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。3、底物浓度 工作浓度 20-200umol/L， dNTPs 浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在 PCR 反应中，4 种 dNTP 必须以等摩尔浓度配制

55、，以减少 PCR 反应的错配误差并提高使用效率。4、Taq DNA 聚合酶 75-80时具有最高的聚合酶活性，150 个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95仍有活性，应用浓度一般为 1-2.5u/100ul 反应体积。5、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA 片段产率下降。退火温度与引物 Tm 值有关，引物 Tm 值在 55-80 范围较为理想。6、反应温度和循环次数普通 PCR 与随机引物 PCR(RAPD)有何区别？AP-PCR 和普通 PCR 的区别PCR 的工作原理：PCR 技术又称为聚合酶链式反应技术，是一种在体外扩增核

56、酸的技术。该技术模拟天然 DNA 的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4 种 dNTP 和耐热 DNA 聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两端已知序列之间的 DNA 区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三部反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环 n 次，介于两个引物之间的新生 DNA 片段理论上达到 2n 拷贝。RAPD 技术是建立在 PCR 基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组 DNA 为模板，以人工合成的随机核苷酸序列(8-10bp 碱基)为引物，在热稳定的 DNA 聚合酶作用，非定点的扩增 DNA 片段。RAPD 的

57、特点：(1)设计引物不需要知道模板 DNA 序列；(2)用一个引物可以扩增出许多片段；(3)重复性较差；AP-PCR 即 arbitrary primer PCR(任意引物 PCR)，是指在对模板顺序列一无所知的情况下，通过随意设计或选择一个非特异性引物，在 PCR 反应体系中，首先在不严格条件下使引物与模板DNA 中许多序列通过错配而复性。在理论上，并不一定要求整个引物都与模板复性，而只要引物的一部分特别是 3端有 3-4 个以上碱基与模板互补复性，既可使引物延伸，一旦在两条单链上相距一定距离且有反向复性引物存在，则可在 Taq DNA 聚合酶的作用下进行 DNA 片段的扩增， 经 1 至数轮不严格条件下的 PCR 循环后，再于严格条件下进行扩增。经 DNA 测序凝胶电泳分离后，即可得到 DNA 指纹图，通过对不同来源基因指纹图之间的比较，即可反映出待分析基因组的特征。例如 AP-PCR 在 mRNA 差异显示中的运用，就是根据 mRNA 3端都有 poly(A)。75、核小体定位（ Nucleosome positioning）： 由于核小体与 DNA 的动态相互作用，大多数