植物组织培养(2)

1、.植物组织培养： 是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基， 对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞愈伤组织（ callus） ：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织植物组织培养的特点1.组培技术是无菌操作技术。2.组培材料处于完全的异养状态。3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。4.组织培养物可以形成克隆（clon

2、e，无性繁殖系） ，也可以进行茎芽增殖或生根5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层， 且气孔保卫细胞功能缺乏， 气孔始终都是张开的。6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调植物组织培养的研究类型组织培养器官培养胚胎培养细胞培养原生质体培养植物组织培养的研究任务研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、 组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等德

3、国植物学家schleiden 和动物学家schwann 于 1838-1839 年提出的细胞学说德国植物学家haberlandt 于 1902 年提出了植物细胞具有全能性李继侗和沈同1933 年成功培养了银杏的胚。1952 年，morel 和 martin 提出了植物脱毒（virus free ）技术guha 和 maheshwari 等花药培养cocking 等 -原生质体培养.carlson 等原生质体融合植物组织培养的应用快繁和脱毒育种次生代谢物生产种质保存在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用离体快繁（试管苗和人工种子）试管苗特点繁殖系数大、速度快，苗木整齐一致，周年生产人工种子指植物

4、离体培养中产生的胚状体或不定芽， 被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。具有试管苗的优点外，还具有以下优点：1）便于贮藏和运输、可直接播种和机械化操作；2）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质培育新品种或创制新物种单倍体育种离体选择突变体培育远源杂种基因工程育种单倍体育种手段：花药和花粉培养优点：所有基因均能表现，基因型可快速纯合成果：已育成大面积种植的品种离体选择突变体手段：愈伤组织、悬浮培养细胞易变异、细胞数量大，有利于突变体筛选优点：多用于抗性筛选成果：已选出一些抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产培育远源

5、杂种胚培养可克服受精后障碍导致的远源杂交不孕，产生远源杂交后代，育成新物种 .苹果 ,梨,大白菜和甘蓝、栽培棉和野生棉原生质体融合可克服有性杂交不亲和性，获得体细胞杂种.马铃薯和番茄、烟草和龙葵基因工程育种农杆菌介导法、基因枪法均基于植物组织培养技术。.抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆性、品质改良次生代谢物生产:利用组织和细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物植物种质资源的离体保存优点：节约人力、物力和土地，防止有害病虫的传播，便于种质资源的交换和转移培养基的成分水矿质元素碳水化合物生理活性物质生长调节剂附加物天然添加物水水质软化装置离子交换反向渗透蒸馏矿质元素大量 -氮、磷、钾、钙

6、、镁、硫微量 -铁、锰、硼、锌、铜、钼碳水化合物作用：提供碳源、维持渗透压通常碳源用蔗糖低浓度（ 1.52.5）的糖有利于木质部的生长；高浓度（ 3 4）有利于韧皮部生理活性物质维生素 -作用：辅酶肌醇 -作用：帮助活性物质发挥作用，使培养物快速生长，促进胚状体及芽的形成氨基酸及其酰胺类-有机氮源、缓冲作用、调节体内平衡单核苷酸植物生长调节剂六大类植物激素生长素细胞分裂素赤霉素脱落酸乙烯.油菜素内酯生长素 / 细胞分裂素相互作用生长素细胞分裂素比率关系，用于组培中决定芽和 / 或根的形成细胞分裂素对生长素的浓度比值高时，倾向于形成芽生长素细胞分裂素的浓度比值高时，倾向于形成根两种激素的比值处于

7、中间水平时增强愈伤组织的形成附加物 :胶凝剂螯合剂渗透剂活性炭其他天然添加物椰乳 ,水解酪蛋白 ,酵母提取液作用：提供天然微量营养成分、生理活性物质和生长调节剂等缺点：成分不确定，影响实验重复性母液（贮备液）注意事项各种药品要充分溶解后才能混合。混合时要注意先后顺序，避免相互结合生成沉淀。铁盐单独配制，一般用硫酸亚铁和edta-na2 通过加热形成稳定的螯合铁贮存。生长素类先用少量95乙醇或1mol/l naoh 加热助溶后，用水定容。细胞分裂素类先用少量1mol/l 盐酸溶解，再用水定容培养基制备加一定量水，依次加入需要量的母液。加入需要量的蔗糖，溶解，定容。调节 ph 值。加入需要量的琼脂

8、，加热溶解（要不断搅拌）。分装：在琼脂未凝时（ 40左右凝固）分装，量一般为容器的 1/4 1/3 ，注意不要沾到容器口。封口。灭菌。存放。注意事项不能高压灭菌的物质， 在灭菌后温度下降但琼脂尚未凝固时， 在无菌条件下， 用过滤除菌法加入。配好的培养基一般应在两周内用完外植体 :从需要培养的母株分离的一小块植物材料.接种体 :已经培养的植物材料用于继代培养外植体的选择地上部比地下部清洁。外植体越小，克服特殊植物病理问题的机会越大，但同时也降低了存活率。内部的组织比外部的不易受到污染。不同外植体反应不总是相同外植体的灭菌1.根据培养容器大小将材料切割成适当大小；2.流水（自来水）冲洗植物表面；3

9、.在酒精中晃动几秒钟；4.hgcl2（ 0.11%）吐温（润湿剂）2 滴 /100ml ： 3 5min；5.用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗；6.商业漂白剂715%吐温 2 滴 /100ml ： 10 30min ；7.再用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗几次培养条件温度光照 :光周期和光强湿度气相条件顶部空间气体成分对植物生长发育的影响矮化或白化玻璃化软腐自养 / 混合营养乙烯伤害矮化或白化有限的气体交换对组培的效应组培容器尽可能密闭，以防止污染。然而，在一个完全密闭的容器中可能出现气体的堆积，对植物生长造成不利，如产量减少、白化病或坏疽玻璃化产生原因外植体：种类，继代次数；切割方法；在培养基上的放置情

10、况。培养基 :凝胶的浓度和类型 ,细胞分裂素的种类及水平；盐浓度。容器：气体组成和气体浓度环境：温度；光强和光质，湿度；空气流动植物细胞全能性： 是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能.力，能够发育成完整的植株全能性是一种可能性，变为现实必须满足两个条件：解除抑制和给予刺激。细胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性脱分化：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。再分化：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。愈伤组织的形成愈伤组织起源于母体组织增殖细胞。在培养时，通过把全植株的一小部分（外植体）在无菌条件下放到支持生长的

11、培养基上来产生愈伤组织。 激素改变了细胞的代谢使之从静止转变为具有活性培养条件固体培养基暗培养液体培养基的缺点污染损失大不利于气体交换，影响愈伤组织形成愈伤组织的生长诱导期后， 外植体外层细胞开始分裂， 在组织受伤表面形成一种创伤形成层， 愈伤组织的细胞数目迅速增加特点：细胞分裂速率大大超过细胞伸长速率，单个细胞的平均重量下降，体积变小愈伤组织类型质地：松脆、致密高生长素：致密变松脆。低或无生长素或高细胞分裂素：松脆变致密。愈伤组织的保持一段时间后， 由于基本培养物的损耗、 凝胶的干燥以及代谢物的积累， 需要将愈伤组织转到新鲜的培养基上进行继代培养要点：愈伤组织继代培养时要有适当的大小，以保证

12、在新鲜培养基上可以重建生长愈伤组织再分化途径器官发生途径：愈伤组织先产生芽（或根） ，再在另一种培养基上产生根（或芽） ，然后形成完整植株。胚状体发生途径： 愈伤组织形成胚状体， 再在另一种培养基上同时发展成带有根的苗。 也叫无性胚胎发生（无性系） 。.胚状体 -指愈伤组织中形成的与种子中胚相似的具有苗端和根端的双极性结构。也叫体细胞胚体细胞胚胎的特征1.体胚最根本的特征是具有两极性2.体胚的维管组织与外植体的该组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往住总与愈伤组织的维管组织联系3.体胚的维管组织的分布是独立的y 字形，而不定芽的维管组织则无此现象体胚发生的方式直接发生和间接发生直接发生是指

13、体胚直接从原外植体的胚性细胞不经愈伤组织阶段发育而成间接发生是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成多数体胚是间接发生胚性细胞 -与分生组织细胞类似，通常较小， 近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚，可直接发育成体细胞胚胎胚胎发生丛（ ec） :ec是愈伤组织中一种液泡小、胞质浓的小细胞聚集成的丛状结构人工种子海藻酸钠作为人工种子的包埋剂。也发展了用新的自裂胶珠的方法植物组织培养的基本程序1.无菌外植体的获得2.初代培养物的建立3.形态发生和植株再生4.培养产物的观察记载无菌外植体的获得利用各种灭菌剂进行外植体的灭菌。不同器官的灭菌方法1.茎尖、茎段、叶

14、片清水冲洗70酒精浸数秒，再在10次氯酸钙浸泡5 20min无菌水冲洗3 5 次，吸干适当切块，接种2.根、块茎、鳞茎带土，易损伤。仔细刷洗，切除损伤部位，增加灭菌时间或浓度。70酒精浸数秒，再在6 10次氯酸钙浸泡5 20min 。.3.花蕾花蕾中的花药处于无菌状态，采摘后可直接灭菌70酒精浸1030s， 0.1氯化汞浸泡3 10min4.果实、种子有些表面具茸毛或蜡质，需加吐温-80。果实： 70酒精浸数秒，2次氯酸钙1020min 。种子：0.10.2氯化汞浸泡510min培养产物的观察记载愈伤组织诱导率胚状体诱导率芽分化率发根率植物器官培养 -是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进

15、行离体培养的技术植物器官培养根的培养茎段和茎尖培养叶的培养根的培养意义根系生理代谢研究的良好实验体系；研究器官分化、形态建成的良好体系；建立根无性系，用于制药；诱变育种。离体根的培养方法固体培养法：平放液体培养法：振荡固体液体双层培养法：根段形态学上端插入固体培养基，下端朝上浸露在液体培养基中。其他特殊方法离体根所用培养基whitems、 b5 等大量元素减半或减2/3影响离体根生长因素基因型营养条件：氮源、碳源、微量元素、维生素b1激素：生长素ph.光照和温度：一般黑暗有利于根的形成植物茎段培养 -是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养

16、的技术。茎段培养的目的进行植物的离体快速繁殖。研究茎细胞的分裂潜力和全能性。诱导细胞变异和突变体的获得茎段培养的特点和优点特点：以芽生芽的方法进行增殖。优点：容易成功、变异小、性状均一、繁殖速度快。茎段培养产物单苗丛生苗完整植物愈伤组织影响因素基因型激素配比：生长素、细胞分裂素茎尖培养 -是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养类型茎尖分生组织培养普通茎尖培养茎尖培养注意事项取材大小：脱毒小于1mm ，快繁可数毫米。茎尖微小趋向于形成愈伤组织。培养基：多为ms，避免 2,4-d（促使外植体愈伤组织化）。普通茎尖培养与繁殖技术无菌物的建立芽的增殖中间繁殖体的增殖诱导生根移栽生长状态及原

17、因1.生长太慢：茎尖不见明显增大，但颜色转绿进入休眠生长素太低.温度低2.生长过旺：茎尖明显增大，基部产生愈伤组织，茎尖难于伸长，色泽较淡生长素偏高用了 2,4-d光照太弱温度过高3.生长正常茎尖逐渐转绿，基部逐渐膨大，有时形成少量愈伤组织，茎尖逐渐伸长，最终形成小枝。影响茎尖微繁的因素基因型外植体的大小供试植株的生理状态芽的着生部位褐变玻璃化极性后生变化形态发生能力遗传稳定叶的培养意义：研究叶形态建成、光合作用、叶绿体形成等；叶细胞全能性；原生质体融合；无性繁殖系；诱变育种影响叶组织培养的因素基因型细胞分裂素细胞分裂素和生长素的组合供试植株的发育时间和叶龄叶脉极性损伤离体叶组织发育途径直接产

18、生不定芽由愈伤组织产生不定芽胚状体.其他植物胚胎培养是指对植物的胚、 胚乳、胚珠和子房等进行离体培养， 使其发育成完整植株的技术包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养子房培养胚培养成熟胚培养幼胚培养幼胚培养的生长方式正常胚胎发育，维持胚性生长。早熟萌发：迅速萌发为幼苗，不能维持胚性生长胚胎发育过程异养期：球形期以前，需复杂培养基。自养期：心形期开始，可用简单培养基。异养期易夭折，可采用胚乳看护培养，提高成功率影响幼胚培养的因素培养基环境条件：一般黑暗或弱光。胚柄：胚柄的存在对幼胚的存活是关键，可用赤霉素代替胚培养的应用1.克服远缘杂交不亲和性：幼胚培养。2.打破种子休眠，缩短育种周期3.提高种子萌发

19、率4.克服珠心胚的干扰5.种子生活力的快速测定。6.诱导胚状体及胚性愈伤组织，用于快繁胚乳培养 -是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养， 使其发育成完整植株的技术。培养成熟的胚乳时，果实要进行表面消毒，胚乳和胚在无菌条件下切出来。培养未成熟的胚乳时，整个果实要进行消毒，在无菌条件下， 使用立体显微镜小心将胚乳组织切离。 将胚乳从胚组织中分离出来是必须的， 这一步骤的失败， 将导致胚乳愈伤组织和胚起源（二倍体组织）的组织的污染。.影响胚乳培养的因素培养基培养条件胚：诱导成熟胚乳活化，可用赤霉素代替。取材时期：胚乳旺盛生长期较易诱导出愈伤组织。胚乳培养应用大量生产三倍体植株。为染色体工程提

20、供不同染色体组合的植株。研究天然产物生物合成和代谢的实验系统胚珠培养 -是将胚珠从母体分离出来， 无菌条件下让其进一步生长发育， 使其形成植株的技术胚珠 -种子植物的大孢子囊，是孕育雌配子的场所，是种子的前身胚珠培养的类型受精胚珠培养未受精胚珠培养胚珠培养的意义防止杂种胚早期败育，但比幼胚培养容易。为试管受精提供一项基础技术。培养单倍体植株胚珠培养的影响因素培养基：多用nitsch。胎座和子房：有胎座和子房易培养。胚发育时期：球形胚后较易。子房培养 -是指将子房从母体上分离下来，无菌离体培养，使其发育成幼苗的技术子房 -雌蕊基部膨大部分，由子房壁、胎座、胚珠组成。植物离体授粉是指将未授粉的胚珠

21、或子房从母体分离下来，进行无菌培养， 并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。又称离体受精或试管受精目的：克服远源杂交的受精前障碍离体授粉方式离体柱头授粉离体子房授粉离体胚珠授粉.离体授粉成功的标志是授粉后能由胚珠或子房形成有生活力的种子。影响离体授粉受精的因素柱头和花柱：存在有利于受精。胎座：存在有利于受精。取材时期：最好在雌蕊授粉后和花粉管进入子房前。培养基： ca2+能刺激花粉萌发和花粉管生长。培养条件：一般黑暗和弱光花药和花粉培养（单倍体诱导）目的花药和花粉培养的目的是通过使小孢子或花粉粒反复分裂形成胚状体并获得单倍体植物，或者获得芽的形成， 然后通过胚胎发生或芽的生长

22、形成单倍体。 其染色体组成可以通过秋水仙碱或再生技术获得可繁殖的同型纯合二倍体花药培养： 将花粉发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化为苗的技术。花粉培养：先将花粉从花药中游离出来，再进行离体培养共同点：利用花粉（小孢子）染色体的单倍性，培育单倍体植株培养方法花粉发育时期四分孢子期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）其中单核期（尤其中、晚期）是大多数植物花粉诱导的最佳时期。花粉发育时期的检测压片法：醋酸洋红；碘碘化钾染色外形：花药培养材料预处理：低温、花药离心、低剂量辐射、化学试剂（如乙烯利）等。表面消毒接种培养：

23、两条途径（胚状体；器官分化），影响因素（光照、温度等）。花粉培养1.花粉的分离挤压法磁搅拌法漂浮释放法2.培养方法固体培养.液体培养：看护培养微室培养：条件培养看护培养将完整花药接种在琼脂培养基上。将一片无菌滤纸放在花药上。将花粉粒接种在滤纸上ms、 h 适合双子叶b5 适合豆科、十字花科nitsch 适合芸苔属和曼陀罗属n6 适合禾本科植物激素种类和浓度细胞分裂素生长素蔗糖和有机添加物高蔗糖浓度有机添加物：椰乳活性炭单倍体植株的鉴定形态学鉴定：形态特征、结实性、花粉粒大小和着色、气孔大小和数目等；细胞学鉴定分子标记鉴定单倍体植株的染色体加倍自然加倍：核有丝分裂和核融合人工加倍：秋水仙素愈伤组

24、织再生：组织创伤法花粉花药培养的优点1.缩短育种年限。2.提高选择效率：有利于隐性基因性状的选择。3.获得单性别特殊材料：如超雄株。4.作为遗传研究材料。我国成就：禾本科经济作物。花粉花药培养的缺点1.诱导频率低：有的只有百分之几、千分之几甚至更低；2.体细胞干扰问题；.3.倍性变异问题；4.白化苗问题。组培与育种单倍体育种突变育种培育远源杂种基因工程育种突变育种根据突变原因：诱变和无性系变异根据突变的主体： 外植体突变和接种体突变（愈伤组织突变、 悬浮细胞突变和不定芽突变等）诱变 -芽诱变、愈伤组织诱变物理突变剂： x-射线，伽马射线，紫外线等化学突变剂： ems（甲基磺酸乙酯） 、叠氮钠等

25、嵌合体植物 -是指顶端层一到两层细胞遗传上有差异的植物。扇形嵌合体边缘嵌合体外周嵌合体离体合成嵌合体1.愈伤组织混合2.离体嫁接嵌合体的离体培养利用茎尖或腋芽来繁殖嵌合体。 不要用不定芽或体胚， 因为大多数情况下， 它们起源于 l1、 l2 或 l3 其中一层。嵌合体分离嵌合体可以通过诱导不定芽或体胚来分解，因为它们大都起源于一层细胞杂色植物定义杂色器官上不同颜色的不连续斑点类型细胞系杂色： 从一个突变细胞增殖而来的一群单色的细胞。 如果这是一个芽顶点的细胞， 杂色植物就是嵌合体（不是通过有性遗传获得的）非细胞系杂色：所有的细胞基因型相同，但色素基因表达不同（有性遗传）不是所有的嵌合体都是杂色

26、的不是所有的杂色都是嵌合.多用于筛选杂色植物香蕉杜鹃花玫瑰杂色原因基因表达的不同叶片疱疹：叶片的某些区域细胞与其下层的细胞分离病毒基因镶嵌植物快繁 -是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的技术。也叫植物离体繁殖或微繁。植物快繁的特点1.繁殖效率高。周年繁殖，生长速度快。2.培养条件可控性强。3.占用空间小。 30m2 可培育数十万株苗木。4.管理方便，利于自动化控制。5.便于种质保存和交换。植物快繁的器官形成方式短枝发生型丛生芽发生型不定芽发生型胚状体发生型原球茎发生型短枝发生型 -带叶茎段形成完整植株，再剪成带叶茎段继代成苗。特点：一次成苗，性

27、状稳定，过程简单，成活率高花卉和葡萄的试管苗生产常用此法。丛生芽发生型 -顶芽或腋芽不断发生腋芽而呈丛生芽，再将单芽诱导生根成苗特点：性状稳定，增殖率高大多数植物快繁的主要方式。不定芽发生型 -外植体脱分化形成愈伤组织， 再分化产生不定芽， 或不经愈伤组织直接形成不定芽，再将芽诱导生根成苗。特点：增殖率高于丛生芽发生型，但较易变异，并会导致嵌合性状发生分离。许多植物快繁的主要方式。胚状体发生型 -外植体经愈伤组织发育成胚状体或直接发育成胚状体，直接成苗特点：增殖率最高，但胚状体发生和发育较复杂。目前此法应用尚不广泛.原球茎发生型 -茎尖或腋芽培养产生原球茎， 增殖形成原球茎丛， 再切割增殖或培

28、养成完整植株是兰花唯一有效的大规模无性繁殖方法，促使了兰花工业的形成。植物快繁的程序阶段：无菌培养的建立；阶段：繁殖体的增殖；阶段：芽苗的生根；阶段：小植株的移栽驯化阶段：无菌培养的建立母株和外植体的选取无菌培养物的获得外植体的启动生长双层培养 -固体培养基上面加20ml 的液体培养基，避免继代培养。这可以降低成本经典的双层培养基成分knop 大量元素1/2 浓度活性炭蔗糖生长素植物细胞培养 -是指将植物单细胞或细胞团进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术植物单细胞培养-是指将植物单细胞进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。单细胞的分离机械分离：研磨、过滤、离心酶解分离：利用果胶酶分

29、解细胞间的胞间层，使其分散。由愈伤组织分离：液体培养、振荡、过滤、离心单细胞培养方法平板培养法看护培养法微室培养法纸桥培养法平板培养 -是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中培养的技术悬浮培养 -是将游离细胞或细胞团按一定密度， 悬浮在液体培养基中不断地搅拌或振荡进行培养的技术.悬浮培养特点可以使培养细胞快速大量增殖。双子叶植物比单子叶植物更容易建立悬浮培养。大多数建立悬浮培养的方法要求首先在离体条件下获得愈伤组织悬浮培养很少只由单细胞组成。大多数除了单独游离的细胞外，都有细胞团。建立了悬浮培养后，需要结合过滤，进行反复继代培养，以降低细胞团的大小。细胞团中的细胞与单独游离的细胞其微环境是不同的。培养方法