《酶免疫技术》课件.ppt

1、,第八章 酶免疫技术,教学目的要求： 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原；熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理 4.掌握酶免疫测定的应用,放射免疫技术,荧光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,基本原理,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,第一节 酶免疫技术的特点,基本原理,酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,第一节

2、 酶免疫技术的特点,一、酶和酶作用底物,（一）标记酶的要求： 活性高，纯度高 作用专一性强 性质稳定，易与抗原或抗体偶联 测定方法简便易行、敏感、精确 酶和底物对人体无害 酶和底物价廉易得,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,RZ值：403nm （辅基）与275nm（主酶）OD值之比,纯度数（RZ）值与酶活性无关，酶活性单位（U）比RZ值更为重要,酶的纯度并不代表酶的活力,国内以辣根过氧化酶最为常用,1、辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase ,HRP）,（一）常用的酶,DH2+H2O2 D+2H2O,供氢

3、体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,HRP催化的反应式为：,HRP,邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。,四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP常用底物,（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP),是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取,AP的 底物,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,敏感性高于HRP,但不

4、易获得高纯度的制品、稳定性差，价格贵,（三）-半乳糖苷酶 （-galactosidase，-Gal）,源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。,-Gal 的底物,4-甲基伞酮基-D半乳糖苷（ 4MUG ）,酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计测量。,二、酶标记抗体或抗原,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物 酶标记物,通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物,（一）酶标记抗体或抗原的制备,标记方法要求,技术方法简单、产率高，重复性好,标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性,酶标记物稳定 ，不易发生解离,制备方法,2.过碘酸钠氧化法 常用于HRP标记抗体或抗原,1.戊二醛交联法

5、适合各种酶蛋白的标记。,（二）酶标记物的纯化与鉴定,1酶标记物的纯化,标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。,常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。,2.酶标记物的鉴定,（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。,（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。,三、固相载体,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原:就

6、是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,（一）固相载体的要求,结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济,（二）固相载体的种类,1塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。,2微颗粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒。,3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。,微量反应板,（三）包被与封闭,将抗原或抗体固相化结合在固相载体上的过程称为包被（coating)。,以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为例说明免疫吸附的过程： 抗原（抗体）用

7、PH9.6的碳酸盐溶液稀释 4C过夜用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未吸附的位点，此过程叫做封闭。,24,第二节 酶免疫技术的分类,克隆酶供体免疫测定,酶免疫分析技术,酶免疫组织化学技术,酶免疫测定技术,均相酶免疫测定,异相酶免疫测定,酶放大免疫测定技术,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定： 酶联免疫吸附试验(ELISA),组织切片或其它标本中抗原的定位分析,液体标本中抗原或 抗体的定性和定量,一、均相酶免疫测定法,酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。,一、均相酶免疫测

8、定法,基本原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，其中的酶活性将发生改变。,因此，不需对反应液中结合和游离的酶标记物进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。,二、异相液相酶免疫测定法,基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的方法分离游离的和结合的酶标记物，然后对经酶催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相酶免疫测定法。,第三节 酶联免疫吸附试验（ELISA）,一、基本原理,底物显色 定性或定量的分析,包被 将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面,反应 加入待测抗体或 抗原和酶标

9、抗原 或抗体,洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离,1,2,3,4,二、方法类型及反应原理,（一）检测抗原的方法,将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗原的含量。,1.双抗体夹心法,双抗体夹心法检测抗原,适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原,（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。,2技术要点,底物,（+）

10、,双抗体夹心法测抗原,2.双位点一步法检测抗原,即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。,双位点一步法检测抗原,在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗,3.加酶作用的底物 显色,2.加待检抗原 和酶标抗体,1.已知抗体包 被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,（+）,3.加酶作用的底物 不显色,2.加待检物（无抗 原）和酶标抗体,1.已知抗体包 被载体,Y,Y,Y,Y,E,Y,Y,E,Y,Y,

11、（-）,Y,Y,Y,双位点一步法测抗原,如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。,注意事项,E,底物,固相抗体,标本（抗原浓度高）,酶标抗体,3.竞争法检测抗原,酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。,酶标抗原,竞争法检测抗原,（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤

12、。 （2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。,技术要点,竞争法测抗原,（二）检测抗体的方法,将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,1.间接法,间接法检测抗体,酶标二抗是针对一类免疫球蛋白(如抗人IgG），因此该法只需要变换固相

13、抗原，即可用一种酶标二抗测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性,间接法测抗体,2.双抗原夹心法,将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,同双抗体夹心法。,技术要点,双抗原夹心法检测抗体,4.加酶作用的底物 不显色,双抗原夹心法测抗体,3.竞争法检测抗体,同竞争法结合抗原。,HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其测定具体模式有区别。,1原理,（1）竞争法检测HBcAb： 将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 加入底物，温育

14、，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,2技术要点,竞争法检测HBcAb,3.加酶作用的底物 显色,3.加酶作用的底物 显色,2.加待检抗体 和酶标抗体,1.已知HBcAg包 被载体,（+）,Y,Y,Y,Y,Y,E,2.加待检物（无抗 体）和酶标抗体,1.已知HBcAg包 被载体,（-）,Y,Y,Y,E,Y,Y,Y,E,E,E,E,E,竞争法检测HBcAb,（2）竞争法检测HBeAb： 将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。 加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。 加入酶标HBeAb，温育，洗涤。 加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色

15、深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。,竞争法检测HBeAb,竞争法检测HBeAb,4.捕获法,将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶标抗体复合物。最后根据加底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。,固相抗人lgM抗体,E,标本（含抗体）,抗原,底物,固相捕获法检测lgM抗体,5.加酶作用的底物 不显色,捕获法,方法评价,ELISA具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、应用范围广泛、无反射性同位素污染等优点。 发展最快、应用最广，

16、普及。,试剂盒,（图为瑞士HAMILTON FAME24/20全自动酶免分析仪）,1病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊断。 2蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。 3非肽类激素测定 如T3、T4、雌激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素等。 4药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。,第四节 酶免疫测定的应用,小 结,酶免疫分析技术是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的催化作用提高反应的敏感性。酶免疫分析技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据

17、抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。,展 望,酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单克隆抗体、生物素一亲和素放大系统的应用以及与化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高了分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程度，使酶免疫分析技术不断更新，应用范围不断拓宽。,练 习,1.用于标记的HRP的RZ值应该大于 A.2.4 B.3.0 C.1.5 D.3.5 E.5.0,1.用于标记的HRP的RZ值应该大于B A.2.4 B.3.0 C.1.5 D.3.5 E.5.0,

18、2.RZ表示 A酶活性 B.催化效率 C.标记率 D.酶纯度 E效价,2.RZ表示D A.酶活性 B.催化效率 C.标记率 D.酶纯度 E.效价,3.HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A.278mm B.450mm C.403mm D.495mm E.492mm,3.HRP与底物TMB反应后的测定波长为B A.278mm B.460mm C.403mm D.495mm E.492mm,5.HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A.蓝色 B.橙黄色 C.棕黄色 D.黄色 E.紫色,5.HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈D A.蓝色 B.橙黄色 C.棕黄色 D.黄色 E.紫色,6.辣根过氧化物酶（HRP）的受氢底物为 A.OPD B.TMB C.DAB D.H2O2 E.Eu,6.辣根过氧化物酶（HRP）的受氢底物为D A.OPD B.TMB C.DAB D.H2O2 E.Eu,7.ELISA常用的固相材料为 A.NC膜 B.聚苯乙烯 C.磁性颗粒 D.尼龙膜 E.凝胶,7.EL