植物转基因育种技术.ppt

1、1,转基因技术 与作物育种,2,转基因育种的概念与优点 转基因育种技术的一般操作过程 转基因育种技术的应用成果 转基因的安全性,3,作物转基因育种 就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。 转基因作物（GMC，genetically modified crops）,第一节 植物转基因育种概念及优点,4,与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势： 1.拓宽可利用的基因资源； 2.培育高产、优质、高抗优良品种提供

2、了崭新的育种途径； 3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择； 4. 可以大大提高选择效率，加快育种进程。 此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。,5,Traditional crossbreeding,Recombinant DNA techniques,6,第二节 植物转基因技术的一般操作过程,7,8,技术路线,目的基因分离,植物表达载体的构建,受体材料的准备,遗传转化,转化组织,组织脱分化,转化植株筛选,炼苗,9,1.目的基因的分离,（1）已知基因的获得 化学合成法 PCR扩增 （2）未知基因的获得 构建基因组文库，筛选目的基因 构建cDNA文库，筛选目的基因 mRNA

3、差异显示技术筛选差异表达基因 差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ,10,pGEM-T,银杏叶RNA提取,反转录cDNA,chs全长cDNA的克隆,TA克隆及测序,向chs两端引入酶切位点,双酶切,定向克隆,导入农杆菌,2.植物表达载体的构建,11,3.受体材料的准备,细胞的全能性：分化细胞脱分化 再分化,12,4.遗传转化,（1）间接转化法农杆菌介导转化法 （2）直接转化法 A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法,13,根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成

4、肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。,返 回,14,基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。,返 回,15,电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DN

5、A混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力.,返 回,16,花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.,返 回,17,PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体.,返

6、回,18,表1 几种植物转基因方法比较,19,5.转化组织 农杆菌介导之叶盘转化法,带有转化基因的农杆菌活化,受体植物,叶盘,侵染,共培养,筛选培养,诱导成苗,20,21,22,6.炼苗,23,一、转基因技术的发展现状,第三节 作物的转基因技术的应用成果,自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。,国际农业生物技术应用服务局（ISAAA）统计结果,24,世界银行下属机构预测，世界范围内转基因作物产业的交易额： 2010年达到200亿美元， 1500万农民种植转基因作物 种植国家 先后有30多个国家批准了3000多例田间试验

7、，涉及的植物种类有40多种； 2000年有13个国家种植商品化转基因植物； 2004年有17个国家种植商品化转基因植物。,25,在2008年，转基因作物种植国的数量激增到了25个。其中，种植面积排名前三位的国家分别为，美国（6250万公顷）、阿根廷（2100万公顷）和巴西（1580万公顷）。中国全国生物技术作物种植面积达380万公顷，在全球生物技术作物种植面积超过100万公顷的八个国家中排名第六。 欧洲很少 与世界上其他商业化种植Bt玉米的国家相比，欧盟的种植规模很小。2008年大约10万公顷Bt玉米在欧盟国家被种植。 与美国相比，欧盟的转基因安全管理法规和制度仍然是非常严格的。,26,美国：

8、3900万公顷 加拿大：350万公顷 阿根廷：1350万公顷 中国：210万公顷,27,转基因作物种类 主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，以转基因大豆面积最大。,目标性状 抗除草剂： 2000年使用抗除草剂大豆、玉米和棉花占转基因作物74%。 抗虫和抗病毒病：2000年，Bt玉米、 Bt棉花占19%。 耐除草剂+抗虫性双价的转基因棉花和玉米占7%。,28,美国三大转基因作物历年种植面积,29,First biotech plant product Flavr Savr tomato,30,我国转基因作物研究与利用概况 我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫

9、性达到60，产量比对照增加15，产值增加20，1992年每亩增收200元，遗憾的是由于市场的原因现已不推广。,到1999年我国已批准中试的转基因作物有48项：包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物； 主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。 已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种作物。,31,经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有： 我国自行研制开发的抗虫转基因棉花（转Bt及Bt+CpTI双价抗虫棉）； 2004年种植转基因棉花370万公顷，占棉花种植面积的

10、50% 美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉； 延迟成熟期的转基因番茄； 抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄； 抗CMV转基因甜椒； 转查尔酮合酶（CHS）反义RNA基因矮牵牛。,32,由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。,33,第四节 转基因作物的生物安全性,34,直至今天，转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论。 反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险，可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。 在欧洲，转基因作物被一些媒体称之为“恶魔食品

11、”（frankenstein food）。 Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造、最终又毁灭了这个科学家的怪物。那么，人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己，还是拯救自己呢？,35,对转基因作物的安全性争论，国际上有几个典型的事件。 Pusztai事件： 英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。 后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加

12、州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。 英国皇家学会组织了同行评审，并于1999年月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。,36,斑蝶事件： 1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在Nature杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44的幼虫死亡。 这一实验结果在

13、科学上没有说服力：玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外米，马利筋叶片/CM2上只找到一个玉米花粉；2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。,37,加拿大“超级杂草”事件： 由于基因漂流，在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”，并怪罪于转基因。 基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物

14、栽培品种。举例来说，小麦由、三个基因组组成，它是由分别带有、基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以，以此来禁止转基因作物，也是没有道理的。,38,中国t抗虫棉破坏环境事件： 2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，月日China daily上发表了题为“GM Cotton Damage Enviroment”的文章。 当天,绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响。 月日德国农业报发表了题为 “中国研究：棉破坏环境巨大”。 绿色和平组织的“中国项目主管”声称：“棉农将面对不受控制的超级

15、害虫”、 “转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”、“棉农将被迫使用更多、更毒的农药”。 事实上，抗虫棉在中国实践多年，深受广大棉农的欢迎。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论，反驳绿色和平组织的观点。,39,争论的实质 现在转基因作物的安全性已经成了国际贸易的技术壁垒。 由于某些媒体的炒作，对消费者的心理和转基因作物的产业化已经产生了很大的负面影响。 我们的判断？,40,我们所要了解的-转基因植物的潜在风险: 1. 转基因植物释放引发“超级杂草” 目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。 如果这些基因逐渐在野生种群中

16、定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难以控制的“超级杂草”。,41,2. 转基因植物中35S启动子的生物安全性 启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达空间、表达时间和表达强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。 最常用的启动子是35S启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达。因此已经被引入许多转基因植物中。 潜在风险问题: 35S启动子内有一重组热点。 （1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。 （2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。 （3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致

17、癌变。,42,3. 抗生素抗性标记基因的生物安全性 抗生素抗性标记基因是否导致的在环境中的传播。 目前，转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记。 在过去的几年里，越来越多的报道指出:细菌可以获得对多种抗生素的抗性。这导致人们开始怀疑：转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中。 抗性标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移至体内微生物，从而影响抗生素治疗的有效性。 抗性标记基因产物是否使人体产生抗药性（食品安全性）。,43,4. 转基因食品的安全性 1994年美国Caigene公司的转基因延熟番茄经FDA批准上市，成为第一例通过安全评价的转基因植物食品。 转基因食品对人类的可能危害

18、主要有3大类： （1）可能含有已知或未知的毒素，对人体产生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的过敏源，引起人体的过敏反应。（3）食品某些营养成分或营养质量可能产生变化，使人体出现某种病症。,44,国外对转基因食品管理的现状,1. 国际组织 实质等同原则 表型性状的等同 成分等同 2000年卡塔赫纳生物安全协定书62个国家签署 2001年生物安全议定书 130多个国家签署 2003年生物技术食品的风险评估草案 226个国家表示欢迎,45,2. 美国, 1992年美国公布了转基因作物不需由作市场前评价，除非它引起新的安全性问题。2000 年4月，在国会科学委员会下属的基础研究委员会的调查报告中，坚

19、持认为没有科学的证据之前不能将GMF作为一个新的食品级别 2000年1月美国政府对转基因玉米的种植颁布了限令，以防止害虫对转基因玉米中毒素形成抗药性。美国环境保护局限令美国大部分玉米产区的农场主应至少种植20的传统玉米，在同时种植玉米和棉花的地区，传统玉米要达到50 2001年7月出台了转基因食品管理草案规定，来源于植物且被用于人类或动物的GMF在进入市场之前至少120天，生物工程制造商必须提出申请，并提供此类食品的相关资料，以确认此类食品与相应的传统产品相比具有等同的安全性,46,3. 欧盟,欧盟对GMF持反对态度，1998年提出转基因技术安全性之后，其反对态度更加强硬。他们对转基因技术培育

20、的农作物、家畜以及再加工食品加以抵制，尤其对美国的转基因玉米已终止了进口，然而对于西班牙和德国的转基因玉米却没有采取措施 欧盟的法律由两项：欧盟理事会90220令，于1990年4月颁布实施，该法令中规定了转基因生物的批准程序；1997年5月新食品法规定对转基因产品必须加贴标签,47,4. 其它国家,日本、澳大利亚、俄罗斯、加拿大、韩国、泰国、 巴西的政策基本与国际组织的相同，但是巴西最 近宣布在未查清转基因作物对环境的影响之前， 暂时停止种植转基因大豆。 发展中国家迫切需要解决粮食问题，对于高产的转基因产品表示欢迎，这些国家技术落后，没有相关的转基因成分的检测条件，对于标识问题也只能处于被动地

21、位，基本是按国际组织的要求和生物安全议定书要求执行,48,我国对转基因食品的对策, 1993年12月24日，国家科委颁布实施了基因 工程安全管理办法 1996年7月10日，国家农业部颁布实施了农业 生物基因工程安全管理实施办法 2001年6月6日国务院颁布了农业转基因生物安 全管理条例 2002年4月8日国家卫生部颁布了转基因食品 卫生管理办法,49,由于转基因产品存在一定的风险，如转基因产品本身对人类的毒害作用，转基因作物对环境的破坏性作用，包括转入的外源基因在环境中的扩散、对物种多样性的影响等，因此必须从保障人类健康、发展农业生产和维护生态平衡与社会安全的基础出发，提出一系列具有指导意义的对应策略和行之有效的