微生物资源开发利用-复习.ppt

1、1,微生物资源的开发利用：（1）微生物（2）发酵工程（3）生物转化（4）环境保护及清洁生产,2,一、微生物及其特点,微生物是微小生物的总称，一般只有借助显微镜才能其进行观察。,微生物,病毒,原核生物：,真细菌、古生菌,真核生物：,真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、 单细胞藻类、 原生动物等,3,微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！,1. 人类时时刻刻与微生物“共存”。 是 祸？是 福？,在近代科学中，对人类福利最大的一门科学算是微生物学了。 微生物与人类关系的重要性，你怎么强调都不过分。但微生物是一把十分锋利的双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏。它给人类带来的利益不仅是享受

2、，而且实际上涉及到人类的生存。,4,（1）1664年，英国人虎克（Robert Hooke）曾用原始的显微 镜对生长在皮革表面及蔷薇枯叶上的霉菌进行观察。,2. 微生物的发现和微生物学的建立与发展,1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antony van leeuwenhoek）首次观察到了细菌。他没有上过大学，是一个只会荷兰语的小商人，但却在1680年被选为英国皇家学会的会员。,5,（2）微生物学的奠基,法国人巴斯德（Louis Pasteur） （18221895）,德国人柯赫（Robert Koch） （ 18431910）,6,微生物学的奠基,巴斯德,(1) 发现并证实发酵是由微

3、生物引起的；,(2) 彻底否定了“自然发生”学说；,化学家出生的巴斯德涉足微生物学是为了治疗“酒病”和“蚕病”,著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，空气内确实含有微生物， 是它们引起有机质的腐败。,(3) 免疫学预防接种,首次制成狂犬疫苗,(4)其他贡献,巴斯德消毒法：6065作短时间加热处理，杀死有害微生物,7,8,柯赫,a）细菌纯培养方法的建立,土豆切面 营养明胶 营养琼脂（平皿）,（1）微生物学基本操作技术方面的贡献,b）设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养,c）流动蒸汽灭菌,d）染色观察和显微摄影,9,（2）对病原细菌的研究作出了突出的贡献：,a）具体证实了炭疽杆菌是炭疽病

4、的病原菌；,b）发现了肺结核病的病原菌；（1905年获诺贝尔奖）,c）证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则 著名的柯赫原则,1、 在每一相同病例中都出现这种微生物； 2 、要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来； 3、用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会 重复发生； 4 、从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。,10,11,3. 微生物的特点,个体小、结构简、胃口大、食谱广、 繁殖快、易培养、数量大、分布广、 种类多、变异易、抗性强,12,食谱广：,微生物获取营养的方式多种多样，其食谱之广 是动植物完全无法相比的！,纤维素、木质素、几丁质、角蛋白、石

5、油、甲醇、甲烷、天然气、塑料、酚类、氰化物、各种有机物均可被微生物作为粮食,13,繁殖快：,24小时后： 4722366500万亿个后代，重量达到：4722吨 48小时后：2.2 10 43个后代，重量达到2.2 10 25 吨,相当于4000个地球的重量！,大肠杆菌一个细胞重约10 12 克，平均20分钟繁殖一代,一头500 kg的食用公牛，24小时生产 0.5 kg蛋白质, 而同样重量的酵母菌，以质量较次的糖液（如糖蜜） 和氨水为原料，24小时可以生产 50000 kg优质蛋白质。,14,易培养：,很多微生物都可以非常方便地进行人工培养！,数量大：,在自然界中（土壤、水体、空气，动植物体内

6、和体表） 都生存有大量的微生物！,15,变异易：,个体小、结构简、且多与外界环境直接接触 繁殖快、 数量多,短时间内产生大量的变异后代,突变率：10-5 10-10,16,抗（逆）性强：,抗热：有的细菌能在265个大气压，250 的条件下生长； 自然界中细菌生长的最高温度可以达到113 ； 有些细菌的芽孢，需加热煮沸8小时才被杀死,抗寒：有些微生物可以在12 30的低温生长,抗酸碱：细菌能耐受并生长的pH范围：pH 0.5 13,耐渗透压：蜜饯、腌制品，饱和盐水（NaCl, 32%)中 都有微生物生长,抗压力：有些细菌可在1400个大气压下生长,17,4. 新世纪的微生物学,20世纪40年代后

7、，微生物自身的特点使其成为生物学 研究的“明星”，微生物学很快与生物学主流汇合，并被推到 了整个生命科学发展的前沿，获得了迅速的发展，在生命科 学的发展中作出了巨大的贡献。,微生物学与生物学发展的主流汇合、交叉，获得了全面、深入的发展,18,1微生物自身的特点（共性和特性）将会更加受到关注和利用 其中：,共性：微生物具有其他生物共有的基本生物学特性：生长、 繁殖、代谢、共用一套遗传密码等，甚至其基因组 上含有与高等生物同源的基因，充分反映了生物高 度的统一性。 特性：微生物具有其它生物不具备的生物学特性，例如可在 其他生物无法生存的极端环境下生存和繁殖，具有其 他生物不具备的代谢途径和功能，反

8、映了微生物极其 丰富的多样性。,19,微生物自身特性的进一步开发、利用：例如降解性塑料，分解纤维素、生产单细胞蛋白等。 借助（利用）微生物特点的基因工程产业：利用微生物生产药物、疫苗等。,以微生物为研究材料继续对一些基本生命现象进行研究；,微生物产业的开发；,重要致病菌的特点及其防治；,极端环境的微生物的研究；,20,二、发酵工程,发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。 现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、

9、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。,21,Fermentation engineering,上游工程 UPSTREAM PROCESSES,下游工程 DOWNSTREAM PROCESSES,发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成： 上游工程、发酵工程、下游工程,22,UPSTREAM PROCESSES - 菌种 - 菌种扩大培养 培养基配制 灭菌 - 接种,上游工程,Fermentation engineering,23,DOWNSTREAM PROCESSES

10、 - 产品分离提纯 - 废物处理 副产物回收利用,下游工程,发酵工程,24,发酵工程技术,主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术 (1) 有严格的无菌生长环境： 包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术； 在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术； (2) 在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算 机控制技术； (3) 种子培养和生产培养的不同的工艺技术。,25,(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数

11、据再设计更大规模生产的动力学模型。 (5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。,26,1、发酵的定义,（1）、传统发酵 （2）、生化和生理学意义的发酵 （3）、工业上的发酵,27,（2）、生化和生理学意义的发酵,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。 如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。,（1）、传统发酵,最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。,28,（3）、工业上的发酵,泛指利用微

12、生物制造或生产某些产品的过程。 包括： 1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。 2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。 产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。,29,适宜的微生物 保证或控制微生物进行代谢的各种条件 进行微生物发酵的设备 精制成产品的方法的设备,（2）获得发酵产品的条件,2、发酵工业,（1）定义：是指利用生物的生命活动产生的酶对无机或有机原料进行生物加工获得产品；或通过培养生物获得次级代谢产物的工业。,30,3、发酵工业的范围,（1）、以微生物细胞为产物的发酵工业 （2）、以微生物代谢产物为产品的发酵工业 （3）、以微生物酶为产品的发酵工业 （4

13、）、生物转化或修饰化合物的发酵工业 （5）、微生物废水处理和其他,31,微生物产物：微生物细胞，酶，药物活性物质，特殊化学物质和食品添加剂,1、生产微生物细胞物质,定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。 特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。,2、微生物酶发酵,酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。 分类：胞内酶 和胞外酶 生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵

14、条件等方面需给予注意。,3、微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。,4、微生物的生物转化,定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。 最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。,5、微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染 利用微生物发酵保持生态平衡 微生物湿法冶金 利用基因工程菌株开拓发

15、酵工程新领域。,37,发酵工业简介 发酵食品 有机酸 氨基酸 核酸类物质 酶制剂 医药工业（抗生素） 饲料工业（单细胞蛋白 环境工程（废物处理） 其它 （冶金工业）,Fermentation Industry Fermented Foods Organic Acids Amino Acids Nucleotides Enzymes Pharmaceutical (Antibiotics) Feedstuff (eg. SCP) Environmental Application (Waste Treatment) Others (eg. Metallurgical industry),4、发酵

16、工业的特征,发酵过程中离不开微生物的作用 1、发酵原料的选择及预处理 2、微生物菌种的选育及扩大培养 3、发酵设备选择及工艺条件控制：常温、常压。种子扩大培养和发酵采用不同的工艺。 4、发酵产物的分离提取 5、发酵废物的回收和利用,(1)发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 (2)微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种选育，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。,(3)发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反

17、应安全，要求条件简单。 (4)发酵对杂菌的污染的防治至关重要。反应必需在无菌条件下进行。 (5)由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。,(6)发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物。 (7)工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，并可以取得较显著的经济效益。 (8)除利用微生物本身外，也可以用人工构建的遗传工程菌进行反应。,5、发酵方法的类别与流程,1、类别： 根据对氧的需要区分： 厌氧和有氧发酵 根据培养基物理性状区分： 液体和

18、固体发酵 根据从微生物生长特性区分： 分批发酵和连续发酵,2、发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,3. 工业发酵步骤和工艺流程,(1) 用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制 (2) 培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌 (3) 将已培养好的有活性的纯菌株以一定量接到发酵罐中 (4) 将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形 成代谢产物 (5) 将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品 (6) 回收或处理发酵过程中产生的废物和废水,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,发酵原料的预处理,原料不

19、同处理方法也有所差异。 1. 淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖 方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法 2. 糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐 3. 植物纤维原料酸碱法、蒸汽爆破法、酶法 3. 碳氢化合物：石油脱蜡一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发酵,菌种斜面培养,菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种 方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。,种子扩大培养,扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。 固体种子扩大培养一般采用传统的制曲

20、工艺，一般先用克氏瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养。 需氧微生物：将克氏瓶表面培养的菌种接到装有液体培养基的三角瓶中，在摇床上振荡培养。 厌氧微生物：将有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养。,微生物发酵和控制,发酵方式可分为固体发酵和液体发酵两种。 固体发酵：适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。 液体深层发酵：适合于大规模工业化生产。 影响发酵的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。,发酵产物的分离提取,利用菌体：离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分

21、开，也可以用喷雾干燥法直接做成粉剂。 酒精发酵醪蒸馏塔蒸馏； 抗菌素及有机酸根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。 获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。,6、发酵工业的意义与展望,利用遗传工程等先进技术，人工选育和改良菌种 固定化技术广泛应用 开发和采用大型节能高效的发酵装置，自动控制将成为发酵生产控制的主要手段 应用代谢控制技术，发酵生产氨基酸等次级代谢产物 将生物技术理广泛地用于环境工程,第二章 谷氨酸发酵,氨基酸的制造是从1820 年水解蛋白质开始。 1866 年德国的立好生博士利用硫酸水解小麦

22、面筋，分离出一种酸性氨基酸，依据原料的取材，便将此氨基酸命名为谷氨酸。 随后，日本有一教授在探讨海带汁液的鲜味时，提取了谷氨酸，并在1908 年开始制造商品味之素味精。1910 年日本味之素公司用水解法生产谷氨酸，与食盐配合出售。但是这种方法生产谷氨酸耗粮太多，成本太高。 二次世界大战后不久，美国有人提出用发酵法生产谷氨酸的报告。 日本也相继开始了研究，1956 年日本协和发酵公司分离出一种新的细菌，它可以利用100 克葡萄糖转化为40 克以上的谷氨酸。1957 年发酵法味精正式商业性生产，这标志着氨基酸发酵工业的诞生。,氨基酸的制备方法,发酵法：发酵法又可分为直接发酵法与添加前体的发酵法。添

23、加前体法是以氨基酸的中间产物为原料，用微生物法转化为相应的氨基酸。 提取法：将蛋白质原料用酸水解，然后从水解液中提取氨基酸。目前，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生产。 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 合成法：用化学合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。,生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前

24、无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。 2000年,世界氨基酸产值达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。,一、氨基酸发酵,氨基酸是组成蛋白质的基本成分，其中有8种氨基酸是人体不能合成但又必需的氨基酸，称为必需氨基酸，人体只有通过食物来获得。 另外在食品工业中，氨基酸可作为调味料，如谷氨酸钠、肌苷酸钠、鸟苷酸钠可作为鲜味剂，

25、色氨酸和甘氨酸可作为甜味剂， 在食品中添加某些氨基酸可提高其营养价值等等。因此氨基酸的生产具有重要的意义。 表1列出部分氨基酸生产所用的菌株。,59,表1部分氨基酸及其生产所用菌株,氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵 以谷氨酸为例，谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。,自从60年代以来，微生物直接用糖类发酵生产谷氨酸获得成功并投入工业化生产。我国成为世界上最大的味精生产大国。味精成为调味品的重要成员之一，氨基酸的研究和生产得到了迅速发展。随着科学技术的进步，对传统的工艺不断地进行改革。 如何保持传统工艺生产的特有风味，从而使新

26、工艺生产出的产品更具魅力，是今后研究的课题。,味精的产品特性 味精,也称味素,因味精起源于小麦,俗称麸酸钠、谷氨酸钠（分子式C5H8NO4Na ） 。 味精是无色至白色的柱状结晶或白色结晶性粉末,含一分子结晶水，无气味，易溶于水，微溶于乙醇，无吸湿性，对光稳定，中性条件下水溶液加热也不分解，一般情况下无毒性。有很浓的鲜味,味精被食用后,经胃酸作用转化为谷氨酸,被消化吸收构成蛋白质并参与体内其他代谢过程,有较高的营养价值。,味精的使用是否安全？,自从1968年以来，有关谷氨酸的研究报告超过8,000份。 自1970年起美国食品药物管理局(FDA)与 世界卫生组织(WHO)的联合食品专家委员会，就

27、味精的安全性加以慎重研讨，认为一般人味精摄取量可以达到一天0.12公克/公斤体重。 此即表示体重50公斤的人，每天即使食用高达6公克的味精，连续食用一辈子也不会影响到身体的健康。,1987年,联合国粮农组织和世界卫生组织宣布,取消对味精的食用限量,作为一种增加食品风味的调味料,味精不再需要评价其每日容许摄入量,消费者可以放心食用味精。,味精的使用是否安全？,味精安全性报告,美国食品药物管理局（FDA）在1995年8月31日公布一份最新的报告，结论是：对一般人而言，食用正常消费量的味精是安全的，且无任何证据显示食用味精和任何严重的或慢性的疾病有关。 这份报告是美国食品药物管理局（FDA）委托独立

28、的科学研究机构美国实验生物学学会联盟（FASEB）进行长达三年的研究评估后得出的。报告澄清了人们对味精于人体健康的疑虑。,还味精一个清白,美国FDA的研究报告，解除消费者的疑虑，澄清了一般人对味精的误解，也使科学家改变研究态度，而能从正面的角度来思考味精这一种广泛被使用的调味料，到底对人体有哪些重要性，这是二十一世纪的一个重要研究课题。,味精对人体的重要性,1、生物化学的研究显示，味精中的谷氨酸是生物体内氨基酸和碳水化合物代谢的重要桥梁。 2、美国Reeds博士的最新研究发现，饮食中的谷氨酸进入消化道时，提供消化道表面细胞代谢所需的大部分能量，也提供其合成必需氨基酸所需的材料。 3、Schif

29、fman教授的研究证实，食物中添加味精可以增加正常老人和患病老人的摄食量，也显著地改善营养状况和身体免疫力。,中国味精产量走势,中国味精业空间巨大,2001年东南亚地区味精人均消费量： 台湾：2000克 韩国：1200克 日本：1020克 香港：1000克 中国大陆：500克 中国味精消费每年至少有160万吨的空间,作为调味品的市售味精，为干燥颗粒或粉末，因含一定量的食盐而稍有吸湿性，故应密封防潮贮存。商品味精中的谷氨酸钠含量分别有90、80、70、60等不同规格。以80最为常见，其余为精盐。食盐起助鲜作用兼作填充剂。也有不含盐的颗粒较大的“结晶味精”。,谷氨酸生产,工业化生产开始于由水解小麦

30、面筋或大豆蛋白质 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 目前世界产谷氨酸钠30万吨/年，占氨基酸总量的2/3。 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。,谷氨酸理论转化率,如果四碳二羧酸(草酰乙酸、苹果酸)全部由CO2固定获得,则1摩尔葡萄糖生成1摩尔的谷氨酸. C6H12O6+NH3+1.5O2C5H9O4+CO2+3H2O 理论转化率=147/180=81.7%,谷氨酸产生菌的主要特征,1. -酮戊二酸氧化能力微弱: -酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低. 2. 谷氨酸脱氢酶活性强.

31、3. 还原性辅酶(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱. 4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱. 5. 不利用谷氨酸. 6. 耐高糖耐高谷氨酸 . 7. CO2固定能力强. 8 .解除谷氨酸反馈抑制. 9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力.,谷氨酸生产菌细胞膜的通透性,通过用能积累谷氨酸菌株做实验，结果表明：谷氨酸的分泌是由细胞膜控制,控制细胞膜通透性的方法： 控制磷脂的合成； 控制细胞壁的合成；选育温敏突变株,（1）生物素营养缺陷型,作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu

32、向膜外泄漏. 控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10g/L).在发酵初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换.,突变株,（2）油酸营养缺陷型 作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右. 控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换.,其他,（3）添加表面活性剂 添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨酸. 机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足

33、,形成不完整的细胞膜. 关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在下进行分裂,形成产酸型细胞.,其他,（4）添加青霉素 机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸. 控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.,其他,谷氨酸发酵强制控制工艺,为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取“强制控制”的方法,如:“高生物素 高吐温”或“高生物素 高青霉素”的方法. 控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量

34、(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。,其他,谷氨酸发酵,1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h.措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短. 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h.措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32,谷氨酸发酵,3.菌体生长停止期:

35、谷氨酸合成.措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通*,控制温度34-37 . 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低.措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐.发酵周期一般为30h.,* 某醋厂转产用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，结果代谢产物没有谷氨酸而产生了乳酸及琥珀酸，其原因是：溶氧不足,谷氨酸发酵,谷氨酸除用于制造味精外还可用于治疗神经衰弱及配制营养注射液，应用前景广泛。,二、谷氨酸发酵的生化过程,（1）是代谢控制发酵的典型代表 （2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的 整个过程可简单的分为2 个阶段: 第1阶段是菌体生长阶段; 第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量

36、积累。,三、合成谷氨酸的生化途径,（一）、GA 的生物合成途径,主要有：Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循环 乙醛酸循环途径，DCA循环 CO2固定反应 -酮戊二酸（ -KGA）的还原氨基化 这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：,87,（二）、GA生物合成的内在因素,从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：,谷氨酸生产菌的生化特征内在因素,1 生物素缺陷型 谷氨酸产生菌大多数为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时,通过控制生物素亚适量(贫乏量) ,

37、引起菌种代谢失调, 使谷氨酸得到大量积累。 2 具有CO2 固定反应的酶系 菌种能利用CO2 产生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量积累。,3.-KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失,这是菌体生成并积累-KGA的关键，从上图可以看出，-KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在-KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由-KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内-KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，-KGA才得以积累，为谷氨酸的生成奠定物质基础。,4. GA产生菌体内的NADPH氧化能力欠缺或丧失,（1）如上图所示，NADPH是

38、-KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。 （2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制-KGA的脱羧氧化有一定的意义。,5. 产生菌体内乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶,该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA发酵的首要条件。糖的代谢才能沿着- 酮戊二酸的方向进行, 从而有利于谷氨酸的积累。,6.菌体有强烈的L-谷氨酸脱氢酶活性,-KGA + NH4+ +NADPH = GA +

39、 NADP (NADH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸) L-谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。 该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下： 偶联反应 -KGA NADPH -KGA GA NADP 异柠檬酸,L-谷氨酸脱氢酶,异柠檬酸脱羧氧化,（三）、GA 生物合成的最理想途径,1. 在前述GA 合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有： 3/2 C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2） = 54.4%,2.在前

40、述GA 合成所必需的条件的基础上（，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有： C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + CO2 产率：147 / 180 = 81.7%,可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。,CO2固定反应,(1)磷酸丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP = 草酰乙酸 + GDP (2)苹果酸酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH = 苹果酸 + NAD 需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+,实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体

41、系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%-81.7%。 目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内.,100,（1）企业计算的糖酸转化率是把GA 发酵前期菌体增殖时期消耗的葡萄糖计算在内，而我们所计算的不包括这一部分葡萄糖，通常这一部分糖占总量的20%左右，当然与企业的技术水平有关。 （2）TCA 循环也不可能完全封闭；-KGA也不可能完全转化为GA；生成的GA也不可能完全分泌的细胞外；发酵液中还存在一定的残糖，通常在0.5%-0.7%之间。,提高GA的潜力,（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+ ，生物素. （2）控制溶氧浓度是非常重要

42、的 低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化 高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，,（四）、生物素对GA发酵的影响,GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH- 生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。,1. 生物素对糖代谢的影响,VH对于糖酵解有促进作用; 对丙酮酸的有氧氧化乙酰辅酶A的生成也有促进作用， 但两者的促进作用不一样，对前者大一些 这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸生成，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。,1. 生物素对糖代谢的影响,另一方面，可

43、以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。封闭乙醛酸循环对于GA发酵的重要性,如何封闭乙醛酸循环呢？,DCA循环（乙醛酸循环）的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响： 为醋酸诱导 受琥珀酸阻遏，其活性受琥珀酸的抑制.（受到Glucose的阻遏）,如何封闭乙醛酸循环呢？,当VH缺乏时： （1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低； （2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强； 两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解

44、酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。,2. 生物素对氮代谢的影响,由以上分析可知，当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱。 当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA 循环（乙醛酸循环）正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能量水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。,108,以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物

45、素的浓度，以保证产物的正常合成。,3. VH对菌体细胞膜通透性的影响,菌体进入产物合成期时，有GA的产生，如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L-谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使由GlucoseGA的高效率转化，反之，如果。可见，改善细胞膜通透性的重要性 如何进行呢？,谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。 VH对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下

46、：,其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH，VH在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。,112,（五）GA发酵的外在因素,GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性。 但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。,1.供氧浓度,过量：NADPH的再氧化能力会加强，使-KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。 供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。,

47、2. NH4+浓度,（1）影响到发酵液的pH值 （2）与产物的形成有关： NH4+过量，菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产酸阶段Glu会受谷氨酰胺合成酶作用转化为谷氨酰胺（ Gln） NH4+不足，不利于-KGA的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调节,NH4+与产物的形成,NH4+的供给方式： （1）液氨 （2）流加0.8%尿素,3.磷酸盐,过量： （1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等 （2）产生并积累缬氨酸（ Val）,发酵过程中,要严格控制NH4 + 和P 的含量,环境条件,4. 发酵液的碳氮比 发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。在一定范围内

48、, 谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加, 但糖含量过高, 渗透压过大, 对菌体生长不利, 谷氨酸对糖的转化率低。 发酵液中还原糖的含量一般应控制在10 %13 % 。,环境条件,氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨基来源，大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌体。 谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多，一般发酵工业碳氮比为100：0.2-2.0，谷氨酸发酵的碳氮比为100：15-21。 在谷氨酸发酵过程中,应正确控制碳氮比。一般在菌体生长期碳氮比应大一些(氮低）,在产酸期,碳氮比应小些(氮高） 。在碳源和氮源的比为31时，谷氨酸棒状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源的

49、比为41时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不合成谷氨酸。,环境条件,5. 生物素 谷氨酸产生菌是营养缺陷型, 对生长繁殖、代谢产物的影响非常明显。 当生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸, 同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成, 使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出,谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%; 生物素亚适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出,有利于谷氨酸的积累, 发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸的92%左右。因此,要根据发酵时期来控制生物素的含量。,环境条件,

50、6. 发酵温度 谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度,即3032 。温度过低, 菌体生长繁殖慢;若温度过高,菌体易衰老, 生产中表现为DO 值增长慢, 耗糖慢, pH值高, 最终发酵周期长,产酸少。 发酵中、后期菌体生长基本停止, 为积累大量谷氨酸, 应适当提高发酵温度,但温度过高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。,环境条件,7. pH值 1） pH值对谷氨酸产生菌生长的影响 谷氨酸产生菌象其它微生物一样, 有最适生长pH值范围, 当高于或低于这个值时:(1) 菌体内的酶受到抑制, 菌体新陈代谢受阻, 生长停滞; (2) 菌体细胞膜所带电荷发生改变, 从而改变细胞膜的渗透性, 影响菌体对营养的吸收和

51、代谢产物的排出; (3) 影响培养基组分和中间代谢产物的离解, 从而影响菌体对这些物质的利用。,环境条件,2） pH值对谷氨酸积累的影响 谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最适pH为7.07.2 ,当发酵液的pH值偏酸时(pH 5.0-5.8) ,谷氨酸脱氢酶受到抑制,代谢向着生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向进行。 在发酵后期由于耗用大量NH4+ ,pH值下降, 此时就要进行pH值调节,以保证发酵的正常进行。,环境条件,pH发生变化的主要原因是培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累。 如当谷氨酸棒状杆菌利用糖类物质不断生成谷氨酸时，培养液的pH就会下降。而碱性物质的消耗和氨的生成等则会导致

52、培养液的pH上升。 pH：前期pH（7.5-8.0），中后期pH7.0-7.6。通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补充氮源。,环境条件,8. 通风 （同1.供氧浓度） 通风的实质就是供氧并使菌体和培养基充分混合。谷氨酸产生菌为兼性好氧菌, 在有氧、无氧的条件下都能生长,只是其代谢产物不同。在谷氨酸发酵过程中,通风必须适度。 风量过大,氧气充足,在长菌阶段表现为耗糖慢, 菌体生长慢, pH值偏高, 产酸阶段, 供氢体被氧化,谷氨酸合成受阻,积累 - 酮戊二酸; 风量小, 供氧不足, 长菌阶段表现为菌体生长快,在产酸阶段,葡萄糖进入菌体后, 进行不完全氧化,产物由谷氨酸变为乳酸。,环境条

53、件,9. 泡沫 谷氨酸发酵是好气性发酵, 因通风和搅拌产生泡沫是正常的, 但泡沫过多会带来一系列问题: (1) 泡沫形成泡盖时, 代谢产生的气体不能及时排出,妨碍菌体呼吸作用,影响菌体的正常代谢; (2) 泡沫过多, 发酵液会外溢,造成浪费和污染; (3) 泡沫过多,易冲上罐顶,造成染菌。因此,在谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败的关键。,谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系,谷氨酸发酵过程中,生产菌种的特性、生长素、发酵温度、pH值、通风和发酵产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要因素。在实际生产中,只有针对存在的问题,严格控制工艺条件,才能达到稳产、高产的目的。,假设人们想利用葡萄糖、

54、谷氨酸棒状杆菌生产-酮戊二酸，请你利用现有知识，如何设计一个大量积累-酮戊二酸的方案? 菌种：对谷氨酸捧状杆菌进行诱变处理，选育不能合成谷氨酸脱氢酶的菌种 条件：氧（通风）、NH4+、C/N；pH、磷酸盐、温度、生物素、 Mn+,代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。 代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。 人工控制代谢的手段： (1)改变微生物遗传特性(遗传学方法）； (2)控制发酵条件（生物化学方法）； (3)改变细胞膜透性；,总结,1 营养缺陷型菌株的应用,末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培

55、养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C 。,(一)遗传学方法,(2) 分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷型克服协同、或累加抗反馈抑制，积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物,分支途径赖氨酸发酵:谷氨酸棒杆菌的Hom,Hom：谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因。 （缺陷型或进行基因敲除 ）,2 抗反馈控制突变株的应用,抗反馈控制突变株是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株。 抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷型回复突变株中获得。,3 选育组成型突变株和超产突变株,如果调节

56、基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，该突变株称为组成型突变株。 少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高得多的酶，这种突变株称为超产突变株。,（二）生物化学方法,1. 添加前体*绕过反馈控制点：能使某种代谢产物大量产生,2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物。 3. 发酵与分离过程耦合。 4. 控制发酵的培养基成分。 *在微生物的生物合成过程中，有些化合物能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分，而化合物本身的

57、结构没有大的变化，这些物质称为前体。,（三）控制细胞膜渗透性,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。 1. 用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如: 在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu； 控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性； 当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；,（三）控制细胞膜渗透性,2. 利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型 如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。 甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用

58、甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，适量添加青霉素也可以获得大量谷氨酸。,四、谷氨酸发酵 1）谷氨酸生产菌,谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌。 我国使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌AS1.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6-13等。,谷氨酸棒杆菌,生产菌株特点,在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一些共同特点: 革兰氏阳性 菌体为球形、短杆至棒状 不形成芽孢 没有鞭毛，不能运动 需要生物素作为生长因子 在通气条件下才能产生谷氨酸。,2）生产原料,发酵生产谷氨酸的原料有 淀粉质原料：玉米

59、、小麦、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最为常用； 大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，过滤后可供配制培养基。 糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜； 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。 氮源料：尿素或氨水。,3）工艺流程,味精生产全过程可分五个部分： 原料的预处理及淀粉水解糖的制取； 谷氨酸生产菌种子的扩大培养； 谷氨酸发酵； 谷氨酸的提取与分离； 由谷氨酸制成味精及味精成品加工 。,味精生产的主要原材料为淀粉 辅助材料包括硫酸、液氨、碳酸钠、活性碳、液碱、盐、消泡剂、淀粉酶等,年产12万吨味精，主要原辅材料耗用如下表：项目单位：吨淀粉196,870液氨 31,108硫酸 35,000碳酸钠 30,000活性碳 2,500液碱 40,000盐 8,000消泡剂 77,960淀粉酶 11,694,4）发酵生产工艺 培养基成分,碳源：碳源是构成