实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备ww.ppt

1、实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备,实验目的,学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。,实验原理,用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。,实验材料和试剂,实验材料：E. coli DH10B菌(R-，M-，Amp-)。 实验试剂： LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用

2、 NaOH 调pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。 LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 0.1mol/L CaCl2溶液：称取2.22g CaCl2(无水,分析纯)，溶于100mL重蒸水中，定容至200mL，高压灭菌。,实验仪器,台式高速冷冻离心机,恒温摇床,制冰机,实验步骤,菌体的培养 受体菌的培养从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH10B单菌落，接种于3-5mL LB液体培养基中，37下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。 再将该菌悬液以 1: 100-1: 50 的比例接种于100mL LB液体培养基中，37振荡培养

3、2-3h 至OD600为0.4-0.5左右。,菌液无菌条件下移入50ml 离心管中，冰上放置10min，使菌液冷却至0 。4，3,000rpm，离心10min。 弃上清，在冰浴上加入10ml预冷的无菌CaCl2 (0.1 mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置 15-30 min 后，4 下 3000g 离心10 min。 弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞，200L/份分装到预冷的无菌Ep 管中，4保存备用。(如加入15%的甘油，-70保存，可保存一年）。,2. 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法),（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上

4、冷却20-30min，于4，4000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）； （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；,（4）04，4000rmin离心10min； （5）弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，4000rmin离心10min； （6）弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。,实验注意事项,细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。,4 感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要