酶组织化学应用.ppt

1、酶组织化学的应用 姜玉峰 石河子大学医学院组胚教研室,酶组织化学基本反应原理 酶作用底物 + 相关化学试剂 反应产物沉淀（有色）,酶,（孵育液内）,（组织细胞内）,（镜下观察）,显示酶的组织化学方法 1.金属沉淀法：磷酸酶的显示 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅 2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法 3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示,酸性磷酸酶,底物 酶,初级反应产物（PRP）,重氮盐,最终反应产物（FRP）,（一）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP） 又称碱性磷酸单酯酶（EC3.1.3.1） 在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适PH 9.2-9

2、.4 激活剂: 如Mg+, Mn+, 某些氨基酸等 抑制剂: 氰化物、砷酸盐等,（一）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， AKP） 分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运功 能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘; 应用：1. 肝脏病、白血病的研究诊断; 2. 骨的发生和代谢疾病;,显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【基本原理】 甘油磷酸钠 磷酸酯+Ca+ 磷酸钙 磷酸钴 硫化钴 【孵育液】 孵育液的成分： 3% -甘油磷酸钠 10 ml 2% 巴比妥钠 10 ml 2% Ca

3、Cl2 20 ml 5% MgSO4 1 ml 双蒸水 5 ml,AKP,显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【操作步骤】 1. 新鲜组织低温冰冻切片 2. 不固定切片直接进作用液, 或用1%氯化钙固定5 分钟-2小时, 4, 蒸馏水洗 3. 作用液10-60分钟, 37 4. 蒸馏水洗 5. 2%硝酸钴1分钟 6. 蒸馏水洗,显示碱性磷酸酶的常用方法: 1. 钙钴法(Gomori-Takamatsu法) 【操作步骤】 7. 12%硫化铵1分钟 8. 蒸馏水洗 9. 甘油明胶封片, 或脱水, 透明, 中性树胶封片 【结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化

4、钴沉淀,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X100,肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法 X200,2. 偶氮偶联法 Gomori萘酚磷酸酯法 AKP在碱性条件下将-萘基磷酸钠水解出-萘酚, 随后-萘酚与固蓝B盐在酶活性部位偶联, 形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀 【孵育液】 -萘基磷酸钠, 蒸馏水, 5%四硼酸钠, 10%硫酸镁, 固蓝B盐,2. 偶氮偶联法 六偶氮对品红与-萘酚偶联-以萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氮对品红偶联 【孵育液】萘酚AS-BI磷酸钠, 二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO), Tris-cl或巴比妥醋酸缓冲液, 六偶氮对品红 【操作步骤】 1. 小块组织液氮骤冷

5、, 低温冰箱切片 2. 甲醛钙液(Fca)固定5分钟, 4, 然后蒸馏水洗, 也可不固定,3. 作用液5-60分钟, 37或室温 4. 蒸馏水洗 5. 4%甲醛固定15分钟-2小时, 室温 6. 自来水洗,蒸馏水洗 7. 1%甲基绿5-10分钟, 蒸馏水洗 8. 甘油明胶封片, 或丙酮-丙酮甲苯-DPX封固 【结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色,酸性磷酸酶(ACP) 1、反应原理（铅法）：,R-O-PO3Na2 R-OH + H3PO4 (-甘油磷酸钠) H3PO4 + Pb(NO3)2 Pb3(PO4)2 Pb3(PO4)2 + (NH4)2S PbS(棕黑色),2、孵育液的成分

6、： 0. 5 mol/L 醋酸盐缓冲液（ pH 5.0 ） 18.5 ml -甘油磷酸钠 45mg 2%Pb(NO3)2 1.5 mg,ACP,pH 5.0,AKP底物： AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB蓝色 固红TR红色,(二)酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP) 在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解 最适PH为4.8-5.2 抑制剂因组织差异而不同: 酒石酸, 氟化物, 0.5%甲醛 分布: 主要位于溶酶体内 应用: 前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+) Hodgins淋巴, 胃癌, 肺癌, 乳腺癌等(+) 尤文氏瘤, 成骨肉瘤等(-),

7、显示酸性磷酸酶的常用方法 1. 酸性磷酸酶硝酸铅法 【基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似 甘油磷酸钠 磷酸酯+铅 磷酸铅 硫化铅（黑色） 【孵育液】硝酸铅,巴比妥-硝酸盐缓冲液，-甘油磷酸钠 【结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色,ACP,显示酸性磷酸酶的常用方法 2. 同时偶联法 【基本原理】ACP在酸性条件下水解萘酚AS-TR磷酸酯为萘酚AS-TR和磷酸, 萘酚AS-TR和六偶氮对品红偶联, 在酶活性处形成红色的不溶性复合物 【孵育液】萘酚AS-TR磷酸酯, 六偶氮对品红,【操作步骤】 1. 新鲜组织低温冰箱切片 2. 不固定或吹干后丙酮固定15分钟 3. 用孵育液置于37水浴箱12小时 4

8、. 流水洗,晾干(1-2分钟) 5. 用Mayer苏木精或1%甲基绿复染 6. 流水洗10分钟 7. 常规脱水透明, 中性树胶封片 【结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色,胞核兰色(苏木精复染)或绿色(甲基绿复染),涂片-腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶 X400,(三) 5核苷酸酶(5nucleotidase) 催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5位置水解磷酸酯的水解酶 最适PH因组织而异,小鼠肾为7.5, 睾丸、脑、肝分别为8.5、7.5-8.5、8.0 激活剂：Mg+，Mn + 抑制剂：氟化钠（0.1M NaF），硼酸钠,OH,OH,H,O,H,OH,H,OH,H,碱基(嘌呤、嘧啶）,（H）,+ H2O,

9、Pi,5Nase,HO-CH2,O,H,H,OH,H,OH,（H）,H,碱基,CH2,O,P,HO,5核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶 5核苷酸酶的显示-铅法 【基本原理】5Nase水解底物5单磷酸腺苷 AMP 磷酸+铅 磷酸铅 硫化铅（黑色） 【注意】 5核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似 5Nase AKP 1. 肾组织中分布 肾小管刷状缘(+), 所有 仅肾小管刷状缘(+) 基膜也(+) 2. -甘油磷酸钠 () (+),5Nase,作为底物,(四) 葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-p-酶) 肝细胞特有的功能性酶,分解糖原,维持血糖浓度, 是糖代谢

10、的关键酶 PH6时活性最强,PH8时最稳定,PH5时易变性 抑制剂: 氟化物,锌和氰离子 酒精固定,石蜡包埋后,G6p酶被完全抑制;经甲醛固定而失活 硝酸铅法显示G6p酶: 葡萄糖-6-p 葡萄糖+磷酸 磷酸铅 硫化铅,G6p酶,(五) 腺苷三磷酸酶 又称ATP酶 ATP ADP + Pi + 能量 根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可分为三类ATP酶 1. 肌球蛋白腺苷三磷酸酶 定位于骨骼肌 最适PH为9.0-9.4 被Ca+激活,而被Mg+抑制 常用作区分二型肌纤维: 型(红肌)-收缩慢,活动持久,其酶活性高,染色深 型(白肌)-收缩快,活动不持久,其酶活性低,染色淡,ATPase,

11、2. 膜性腺苷三磷酸酶 又称钠-钾离子激活腺苷三磷酸酶 最适PH7.2-7.5 激活剂: Mg+, Na+,K+ 抑制剂: Ca+, 苦毒毛旋花子甙 常存在于细胞膜,特别是分泌功能活跃的细胞膜。,3. 线粒体腺苷三磷酸酶 心肌最丰富,肝脏次之 心肌的线粒体ATP酶被Mg+激活，而被Ca+抑制 肝细胞线粒体ATP酶可同时被Mg+、 Ca+激活 心肌和肝的线粒体ATP酶均可被对-氯汞苯甲酸 （PCMB）抑制,腺苷三磷酸酶的显示方法 1. 镁激活的ATP酶法(铅法): 在ATP酶活性处,出现棕黑色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性ATPase，也可示线粒体ATPase 2. 钙激活的ATP酶法(钙钴法)

12、: 在ATP酶活性处,出现黑色硫化钴沉淀。主要用于显示肌球蛋白ATPase，区分红肌纤维和白肌纤维,（六）非特异性酯酶 酯酶可分为三类非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶 非特异性酯酶-水解短链脂肪酸的酯 脂酶-水解长链脂肪酸的酯 胆碱酯酶-水解胆碱的酯酶 非特异性酯酶 最适PH 5.0 - 8.0 定位在溶酶体和内质网,在肝、肾、胰和小肠具有较高的酶活性,应用-单核巨噬细胞、T淋巴、中性粒细胞都有非特异性酯酶反应 1. 在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值 2. 可作为T、B淋巴细胞的鉴别 显示非特异性酯酶法-同时偶联法 用乙酸-萘酯或萘酚AS衍生物为

13、底物，在酶作用下，释出-萘酚，与固蓝B或六偶氮对品红偶联，生成紫黑色或红棕色不溶的偶氮染料,（七）胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶-神经组织、肌肉、红细胞中 胆碱酯酶-血浆中含量丰富 显示乙酰胆碱酯酶的方法Karnovsky-Rotts亚铁氰化铜法 【基本原理】 碘化乙酰硫化胆碱 硫代胆碱 + 乙酸 铁氰化钾 亚铁氰化钾 亚铁氰化铜沉淀,乙酰胆碱酯酶,（-SH）,Cu+,氧化还原酶 一类转移电子，催化作用物的氧化还原反应的酶 脱氢酶 如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶 氧化酶 如DOPA氧化酶、细胞色素氧化酶,（一）脱氢酶 脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放出氢，经氢传递系统，使受氢体还原而显色 常以四

14、唑盐和铁氰化钾作为受氢体 组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种,1. 瑚珀酸脱氢酶（SDH） SDH是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。 不需辅酶的存在 SDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜牢固结合 最适PH 7 【显示方法】Pearson 二甲亚砜法 【基本原理】 琥珀酸盐 + 受氢体（四唑盐） 富马酸+还原的受氢体 （无色） （蓝色沉淀）,【作用液】0.1M 琥珀酸钠, 0.1M 磷酸盐缓冲液 PH 7.6 NBT(硝基蓝四唑), 二甲亚砜(DMSO) 【步骤】 1. 新鲜组织低温冰冻切片 2. 作用液1535 分钟 3. 生理盐水洗 4. Fca(氯化钙Formalin)固定10分钟 5. 入80%乙醇5分钟 6. 甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片 【结果】酶活性处为蓝紫色沉淀,小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶 X400,2. 乳酸脱氢酶（LDH） 需辅酶的脱氢酶 广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系 最适PH 7.4 肝、骨骼肌的酶活性高于心肌 【基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互变反应 乳酸盐 + NAD 丙酮酸盐 + （NADH+H+）,LDH,（辅酶）,（还原型辅酶）,（二）过氧化物酶 催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化 见于乳腺、甲状