边做边学大肠杆菌的接种与分离培养

1、到目前为止， 几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关,微生物的类群,原生生物：,原核生物:,真菌:,病毒:,如酵母菌,单细胞的动植物,如草履虫、单细胞藻类等,微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物,无细胞结构,细菌、蓝藻,原核细胞,课题1 微生物的实验室培养,专题2 微生物的培养与应用,1.提供营养和条件,2.防止污染,思考：微生物“吃”什么？,按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质,一培养基：,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等,液体培养基用于工业生产。 （2）按功能来分，可分为选择培养

2、基和鉴别培养基。 （3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,培养基的类型和用途,固体培养基,液体培养基,有无 凝固剂 琼脂,分离 鉴定,工 业 生 产,1.基本成分：,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物,氮源,无机氮源：,有机氮源：,NH4、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含CHON的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源,2.特殊营养：,维生素、碱基等,（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）,3.pH、氧气的需求：,牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。,分析营

3、养构成？,5. 配制原则,目的明确：,营养全面、浓度适宜、比例恰当,适宜的pH值：,有机碳源,异养型：,根据微生物的种类、培养目的选择原料,自养型：,不加碳源,加入缓冲剂,细菌偏碱，真菌偏酸,（CO2碳源）,一、培养基,讨论1:自养和异养微生物的培养基成分的主要区别？,培养基中是否需要添加现成有机物。,培养自养微生物不需要添加有机物；反之培养的是异养微生物。,讨论2:配制了水、碳源、氮源、无机盐的培养基还要满足哪些要求微生物才能生长？,PH、氧气、特殊营养物质,培养乳酸杆菌需要添加 ； 培养霉菌需要调节pH为 ； 培养细菌需要调节pH为 ； 培养厌氧微生物需要提供 条件。,维生素,酸性,中性或

4、微碱性,无氧,二、无菌技术,阅读课本P15-16，回答下列问题：,1.获得纯净培养物的关键是什么？,2.避免杂菌污染的方法主要包括哪四个方面？,防止外来杂菌的入侵,实验操作空间、操作者的衣着和手 。,培养器皿、接种用具和培养基等 。,为避免实验操作时周围环境的微生物污染， 。,已灭菌处理的材料用具与周围物品 。,进行清洁和消毒,进行灭菌,操作应在酒精灯火焰附近进行,避免接触,消毒：指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。,灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,二、无菌技术,阅读课本P15-16，回答下列问题：,3.什么是消毒、灭菌，

5、常用方法有哪些？,灭菌：指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。,消毒的方法：,1、煮沸消毒法: 2、巴氏消毒法： 3、化学药剂消毒法: 4、紫外线消毒：,二、无菌技术,100煮沸5-6min,70-75煮30min或 80煮15min,用酒精擦拭双手消毒；,可杀死微生物细胞和一部分芽孢,可杀死牛奶中的微生物,紫外线照射30min接种室、接种箱、超净工作台,营养不被破坏,用氯气消毒水源；,石炭酸或煤酚皂喷洒接种室、接种箱、超净工作台等,（不耐高温的液体）,（日常生活常用）,1、灼烧灭菌：,灭菌的方法：,二、无菌技术,对接种环、接种针或其他金属用具、也可以对试管口、瓶口灭菌,

6、在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧,一次性接种针（环）,接种环的灼烧顺序？,2、干热灭菌：,灭菌的方法：,二、无菌技术,耐高温且需保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等,干热灭菌箱中160-170 下加热1-2h。,干热灭菌箱,3、高压蒸汽灭菌：,灭菌的方法：,二、无菌技术,对培养基、容器的灭菌,100kPa、121 下维持15-30min.,三、制备培养基,阅读课本P16-17，学习培养基配置的方法：,牛肉膏蛋白胨固体培养基配方 牛肉膏:5.0g 蛋白胨:10.0g NaCl: 5.0g 琼脂: 20g 水: 1000ml pH: 7.4-7.6,琼脂糕点,草莓琼脂牛奶果冻,琼脂果

7、冻茶,琼脂果冻茶,碳源、氮源、磷酸盐、维生素,碳源、氮源、维生素,无机盐,凝固剂,牛肉膏、蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素、有机氮等营养物质。,三、制备牛肉膏、蛋白胨固体培养基,阅读课本P16-17，学习培养基配置的方法：,1.制备流程：,计算,称量,溶化,灭菌,倒平板,培养基：高压蒸汽灭菌法 培养皿：干热灭菌法,牛皮纸,：以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,三、制备牛肉膏、蛋白胨固体培养基,阅读课本P16-17，学习培养基配置的方法：,1.制备流程：,计算,称量,溶化,灭菌,倒平板,讨论1：称量时的是什么？为什么？ 讨论2：溶化时需要不断用玻璃棒搅拌的目的是什么？ 讨论3：倒平板时有哪些注意事项

8、？,牛肉膏比较粘稠，用玻棒挑取，放在称量纸上称量。 动作要求迅速，称后要及时盖上瓶盖。 牛肉膏、蛋白胨都容易受潮,防琼脂糊底使烧杯破裂。,倒平板操作,阅读课本P17，完成相关讨论题目：,1、培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,用手触摸，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手。,2、为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，可以防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。,平板冷凝后，培养基表面的湿度较高，平板倒置可以使培养基表面的水分更好的挥发。,4

9、、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,不能。,倒平板操作,阅读课本P17，完成相关讨论题目：,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。,5、为了防止杂菌污染，需要在哪里进行倒平板操作？,酒精灯火焰附近,例.下面为倒平板的操作示意图， 据图回答：,A,D,C,B,（1）请用字母写出正确的倒平板操作流程： （2）A、B、C中的灭菌方法是 。 （3）D中的操作需要等待 才能进行。,CABD,灼烧灭菌,平板冷却凝固,例.制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒平板的具体描述正确的是( ) 待培养基冷却至40左右时，在酒精灯火焰附近倒

10、平板 将灭过菌的培养皿放在桌面上 左手拔出棉塞,右手拿锥形瓶,使瓶口迅速通过火焰 左手的拇指和食指将皿盖完全打开 培养基倒入培养皿后，左手立即盖上培养皿的皿盖 等待平板冷却510s，将平板倒过来放置A B C D,C,四、纯化大肠杆菌,阅读课本P18-19，学习纯化大肠杆菌的方法：,穿刺接种法,接种微生物的方法有：,斜面接种法,最常用的平板划线法和稀释涂布平板法,四、纯化大肠杆菌,（一）平板划线法,概念：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的 操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的 表面. 结果：在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而 来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,微生物的恒温

11、培养,1、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论：,2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3、在作第二次以及其后的划线操作时，为

12、什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,三、实验操作,1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,问题讨论：,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,2、

13、选择培养基,加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞,耐高温需保持干燥的 物品，160170 12小时,接种环、接种针等 金属用具,7075、30min 80、15min,100、56min,较为温和理化方法，,杀死部分有害菌体,（不包括芽孢、孢子）,强烈的理化方法，,杀死所有微生物,（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸等,高压蒸汽灭菌,培

14、养基， 100KPa、 121、1530min,二.无菌技术：,防止外来杂菌的污染,1.消毒与灭菌：,2、请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,思考,1、消毒和灭菌的原理、实质相同吗？,原理相同：都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。 实质不同：灭菌可以杀死物体内外的全部微生物（包括芽孢和孢子），消毒仅杀死部分微生物,灭菌,灭菌,消毒,2.无菌范围：,实验操作空间消毒,操作者的手、衣着消毒,实验用具灭菌,实验操作过程,酒精灯旁操作,超净工作台,单个 或少数菌体,2

15、.特征：,大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。,3.功能：,1.定义：,三.菌落,鉴定菌种的重要依据,固体培养基上,大量繁殖,子细胞群体,四.大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂,补水定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板：,培养基、培养皿,分散成单个细胞,形成单个菌落,倒平板,约50,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基,二.大肠杆菌的纯化培养：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌：,平板划线法：,菌种,划3个平板,1个不划线,1.接种：,接种环,防止划破培养基,（重复实验）,（空白对照）,问题讨论,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物,杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,6支试管，分别加入9ml无菌水,1