医药学类文献双语版：汉译英

1、介导的shRNA能抑制肺癌细胞livin沉默基因的表达，促进SGC-7901细胞的凋亡背景由于肿瘤细胞抑制细胞凋亡和增殖，抑制细胞凋亡的特定因子将为开发新的治疗策略提供合理的途径。Livin是凋亡抑制蛋白家族的成员，在各种恶性肿瘤的表达中具有重要意义。然而，没有关于胃癌的可用数据。在本研究中，我们发现了livin基因在人胃癌中的表达，并研究了shRNA能抑制肺癌细胞中livin沉默基因的表达，从而促进SGC-7901细胞的凋亡。方法用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法分析livin基因的表达。小干扰核糖核酸真核表达载体具体采用基因重组和核酸测序的方法获得livin基因。然后将脂质体转染蛋白200

2、0转染到SGC-7901细胞中。经逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹试验证实的livin基因使沉默基因在SGC-7901细胞中有效。用G418筛选获得的稳定拷贝。用流式细胞仪检测细胞凋亡。用MTT比色法测定细胞生长状态、5-FU和顺铂的50%抑制浓度。结果40例中，19例(47.5%)为胃癌和SGC 7901细胞。在肿瘤和良性胃溃疡病变的邻近组织中未发现livin基因表达。livin基因的表达与肿瘤的微分化和淋巴结转移一致(p005)。四种小干扰RNA的真核表达载体对基因重组livin基因的建立具有特异性。其中一种能有效降低livin基因的表达，抑制基因不低于70%(P 0.01)。提取重组质粒并

3、转染到胃癌细胞中。通过G418筛选获得的稳定拷贝被放大且精致。livin基因沉默时，胃癌细胞的生殖活性明显低于对照组(P 0.05)。研究还表明，在胃癌细胞治疗中，5-氟尿嘧啶和顺铂对IC50可通过shRNA减少和刺激这些细胞(5-氟尿嘧啶促凋亡和顺铂)。结论：livin基因在胃癌中的过度表达与肿瘤分化和淋巴结转移有关，是胃癌治疗的分子预后因素之一。ShRNA能抑制SGC-7901细胞中livin基因的表达，诱导细胞凋亡。Livin可作为治疗胃癌细胞凋亡的新靶点。1导言胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。大多数患者在早期被诊断患有这种疾病，错过了在最佳时机手术治愈的机会。尽管有了很大的改善，晚期

4、胃癌化疗患者的总生存率仍然很低。癌细胞对化疗的耐药性可能导致手术失败。在耐药的原因中，抑制细胞凋亡起着重要的作用。癌细胞通常以抗凋亡生长为特征1，其介导由不同抗性刺激的凋亡，如DNA损伤、缺氧和营养损失2，3。此外，在临床实践中，凋亡抵抗被认为是肿瘤手术失败的主要原因，因此许多化疗药物和/或放疗都是通过诱导凋亡肿瘤的死亡来实现的4。酶抑制剂(IAPs)是一个新的凋亡蛋白抑制基因家族5，6，包括病毒感染、化疗药物、生长因子和肿瘤坏死因子-(肿瘤坏死因子-凋亡信号通路)/Fas信号通路7-9。IAPs由一组凋亡相关蛋白10组成，可能在预防肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用，是近年来的研究热点。这个家族的新

5、成员是M1-IAP/livin/KIAP/BIRC7(以下简称livin)，它有两种，livin和livin11-14。有证据表明，livin的过表达可以防止各种刺激诱导的细胞凋亡12。有趣的是，发现livin基因在肿瘤细胞中限制性表达，但在正常人组织中不存在或少量存在11-15，并通过允许恶性细胞避免凋亡而导致肿瘤形成。因此，抑制livin基因表达可能是一种有趣的治疗策略。在本研究中，我们研究了livin在胃癌及其邻近组织中的表达。分析livin表达与临床病理参数的关系。此外，我们还探讨了shRNA抑制livin基因表达的可行性，以及shRNA介导的凋亡细胞livin基因沉默对胃癌易感性的影

6、响。2患者和方法2.1患者和肿瘤样本收集40例胃癌和13例胃癌患者行胃切除术(患者年龄29-77岁)。其中良性胃溃疡(慢性浅表性胃炎)患者13例，年龄33 77岁。这些病例均来自南京医科大学第一附属医院。胃癌患者被诊断为TNM 1-4期(UICC，2002)。手术后，立即将肿瘤标本冷冻在液氮中，并在-80下保存直至使用。这是在所有患者知情同意的情况下获得的。2.2逆转录聚合酶链反应技术规程根据制造商的说明，从冷冻组织中提取总核糖核酸(2毫克)进行反转录，最终2微升的体积是100微升的寡核苷酸(dT)15和200微升的MLV逆转录酶(promega，美国)。在聚合酶链反应缓冲液容器中扩增250微

7、升对应于等分试样的cDNA，最后50微升含有25摩尔/毫升的处理剂和1U聚合酶。每个循环扩增35次，30秒内变性曲线达到94。热处理在30秒内从59(livin和b-actin)扩展到30秒内的72。无核糖核酸的病例作为阴性对照纳入逆转录聚合酶链反应。一系列常用的livin和-肌动蛋白治疗剂如下：livin/下游；5 -TCCAACAGGTGCAGGACT-3 ；-肌动蛋白上游，5 -ACGGCAAAGACGATGGAC-3 -肌动蛋白下游，5 -AGCGCAAGTATCCGTGG-3 .产品大小为livin/ 312/258 bp和-肌动蛋白501bp。2.3蛋白质印迹技术分析病理学同质性和

8、脉冲缓冲液50mM tris-HCl (ph 7.5)、250 mm NaCl、0.1% np40和5mM EGTA含有50mM氟化钠、60mM -甘油磷酸酯、0.5mM钒酸钠、0.1mM苄基磺酰氟10g/ml亮胃蛋白酶。蛋白质含量用考马斯亮蓝微盘比色法测定。蛋白质样品在10%变性SDS凝胶上电泳，并转移到聚偏氟乙烯膜上(美国罗氏公司)。膜是一种特异性的主要抗体，与过氧化物酶二级抗体反应(细胞信号技术，美国)，最后通过增强化学荧光实现可视化(细胞信号技术，美国)。单克隆抗体livin (1:250)和肌动蛋白(1:400)，由Alexesis(美国)和Santa Cruz生物技术公司(美国)购

9、买24细胞系和细胞培养我们选择了一个人胃腺癌细胞系进行这项研究。SGC-7901(上海细胞研究所，上海，中国)是一个人细胞系，附有中度分化的胃腺。该细胞系是胃癌细胞的上皮细胞，并生长成贴壁细胞RPMI 1640 (Hyclone公司，美国)，含有10-Life Technologies公司，每毫升100单位青霉素和每毫升100微克链霉素。SGC-7901细胞保存在含5%CO2空气的37潮湿培养箱中。将溶解的顺铂和氟尿嘧啶(中国齐鲁制药厂)储存在4的二甲基亚砜中。2.5 .ShRNA的合成及PGPU/GFP /Neo/livin质粒的制备Livin的ShRNA序列是由siRNASequence-

10、Selector软件(中国上海生物技术股份有限公司集团公司)设计合成的。序列如下(表1)，然后插入到pGPU/GFP/Neo(上海基因制药有限公司.中国)BbsI和BamH地址生成pgpu/GFP/neo/livin和pgpu/GFP/neo/对照质子。2.6建立稳定表达pgpu/GFP/neo/livin和pgpu/GFP/neo/对照转染实验，将SGC-7901细胞接种到6孔板(3105孔密度)中，并在用96孔板(1 104孔密度)和12孔板(1.5 105孔密度)转染前培养24小时。根据制造商的说明，这些细胞用4毫克/孔的PgPu/GFP/Neo/载体、pGPU/GFP/Neo/livi

11、n或PgPu/GFP/Neo/对照质粒与Li-PoFeckamine 2000(life technology ComPaNY，Oshima，ny)转染。转染48小时后，将这些细胞转移至1:15 (v/v)并用遗传霉素(G418) 1000 g/ml培养4周。取出稳定转染的克隆，并储存在400 g/ml G418的培养基容器中，用于进一步研究。2.7细胞生长依赖于贴壁细胞的测定将亲代细胞和稳定表达pgpu/GFP/neo/载体的细胞，以及pgpu/GFP/neo/livin或pgpu/GFP/neo/对照种植在6孔板中。每隔一天收集三孔细胞。手机号码是由一个计数器(库尔特电子公司，迈阿密，佛罗

12、里达州)确定的。种植几天后，用平均标准差记录每孔细胞数。2.8兆吨化验细胞毒性用MTT法测定。将几何生长的细胞置于密度为10000个细胞/孔的96孔板上24小时。接下来，这些细胞用不同浓度的药物处理48小时。向每个孔中加入100微升的MTT溶液(1毫克/毫升)，并将这些细胞在37下培养。四个小时。在上清液中使用异丙醇代替溶解有色甲.微量酶联免疫吸附法测得的吸光度波长为595纳米(SLT)。处理过的细胞的吸光度相当于计算对照细胞的吸光度并显示细胞死亡的百分比。2.9流式细胞术收集细胞，在PBS缓冲液中加入冰冷的70%乙醇，并在-4下保存直至使用。悬浮后，在37下培养100毫升核糖核酸酶(1毫克/

13、毫升)和100毫升聚酰亚胺(400微克/毫升)，并用流式细胞仪分析。2.10统计分析应该使用至少三种不同的实验SD方法来显示数据。实验结果通过学生的T检验进行分析，当P 0.05时，认为有统计学意义。3个结果3.1 .livin在胃肠癌中的表达在本研究中，我们首次证实了反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹技术在40例胃癌、13例癌组织和13例胃粘膜良性病变中的存在。19/40(47.5%)的癌组织显示出mRNA和livin和livin蛋白表达(图1和2)。Livin表达与预后变量有关，如组织学恶性肿瘤和淋巴结转移，但包括年龄、性别、分期和肿瘤细胞浸润程度(表2)。3.2 .前列腺素/绿色荧光蛋白/新

14、蛋白/livin和前列腺素/绿色荧光蛋白/新蛋白/对照的稳定转染和表达我们建立了SGC-7901，用任何pGPU/GFP/Neo/livin、pGPU/GFP/Neo/对照质粒或空的pGPU/GFP/Neo/载体稳定转染(图3)。蛋白质印迹技术和逆转录聚合酶链反应技术用于选择每个转染的克隆，并分析和测定livin基因和蛋白表达。其他的被选择作为延伸和附加研究。(如图4和5所示)，在SGC-7901 GPU/GFP/Neo/livin 2转染中，livin mRNA和蛋白水平降低了90%以上。pGPU/GFP/Neo/livin1转染和阴性对照中未发现Livin表达抑制。因此，SGC-7901前

15、列腺素pu/绿色荧光蛋白/Neo/livin2被用于随后的实验。3.3稳定转染中细胞生长的抑制SGC-7901的生长速率均显著抑制转染。如图所示，SGC-7901细胞数量明显减少。转染后72小时至96小时进行平板培养(p001)，而阴性对照组和亲本细胞。3.4 .凋亡因子很容易刺激稳定转染我们认为SGC-7901基因转染和阴性对照细胞的生长速率明显受到细胞毒性顺铂的抑制。图6显示，在培养后72小时和96小时，与阴性对照和亲代细胞相比，SGC-7901 pGPU/GFP/Neo/livin2转染细胞的数量显著减少。pgpu的Mtt分析显示SGC-7901 /Neo/livin2/GFP对顺铂和氟

16、尿嘧啶的转染比阴性对照亲代细胞更敏感(图7A、6B)。顺铂和5-氟尿嘧啶诱导的凋亡细胞数量比顺铂/绿色荧光蛋白/新生血管生成素/凋亡配体2增加了约2.5-3倍，控制了细胞数量(P0.001第7C条。).此外，与对照细胞相比，它更容易进行稳定转染而不发生自发凋亡(P0.05)。图7C)凋亡刺激。讨论在这项研究中，我们表明，推荐的新成员，一个新的IAP家族成员，被认为与非癌性胃组织的表达不一致，仅在胃癌患者的比例中(47.5%)。这也表明自发凋亡和抑制SGC-7901细胞生长是抑制Livin表达或功能的原因，这使得细胞更容易受到凋亡的刺激。据信有两种活细胞亚型，即A和B，尽管这两种亚型在体外阻止肿瘤坏死因子诱导的凋亡参与-A和抗CD95，但它们显示出一些不同的抗凋亡特征。在阻断由脱氧核糖核酸损伤剂诱导的细胞凋亡方面，活乙肝似乎比活乙肝更有效。对livin在某些组织中分布的研究表明，最近在心脏、胎盘、肺、脾和卵巢中发现了A和B两种亚型，而在脑、骨骼肌和外周血淋巴细胞中检测到了Livin，尤其是在胎儿组织和成人肾中11-14。此外，尽管在一些种类的癌细胞