肺靶向脂质体的研究.ppt

1、肺靶向性脂质体的研究,夏文晓,一 靶向给药系统简介 二 肺靶向给药系统 三 脂质体的分类及新型靶向脂质体 四 脂质体的制备方法 五 脂质体的质量评价与控制 六 脂质体肺靶向性评价 七 肺靶向脂质体研究的实例 八 肺靶向脂质体药品的现状 九 肺靶向脂质体存在的问题,一 靶向给药系统简介 靶向给药系统 (target-oriented drug delivery system,简称TODDS)又称靶向制剂是借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药、胃肠道或全身血液循环而选择性地浓集于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的制剂。,4,靶向制剂的分类 1、按载体的不同，靶向制剂可分为脂质体、毫微粒、毫微球

2、、复合型乳剂等； 2、按给药途径的不同可分为口腔给药系统、直肠给药系统、结肠给药系统、鼻腔给药系统、皮肤给药系统及眼用给药系统等； 3、按靶向部位的不同可分为肝靶向制剂、肺靶向制剂、脑靶向制剂等。,5,靶向制剂分类,靶 向 制 剂,被动靶向制剂,主动靶向制剂,物理化学靶向制剂,二 肺靶向给药系统 1 背景 在我国，肺癌、肺结核等肺部疾病发病率较高且呈快速递增发展趋势。为了治疗这些难治性疾病，我国已投入大量的人力物力，并在药物治疗领域取得了一系列重要进展，但现有治疗药物体内分布不具目标选择性，且用药量大、周期长，产生严重毒副反应与耐药性。对此，理想的治疗策略是开发肺靶向给药系统，肺靶向传递系统(

3、LungTargeted Delivery System，LTDS)系指一类利用载体将药物选择性传递到肺部(病变组织、细胞或细胞内)的新型给药系统，即使药物高度浓集于肺部，从而提高肺部疾病的疗效，降低毒副作用。按药物载体的不同，肺靶向药物载体可分为微球、脂质体、纳米粒等。,2 肺靶向微粒的简介 肺靶向微球 微球(Microspheres)是指药物分散或吸附在高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系。基于肺部组织的生理特点，作为肺靶向微球制剂，关键是控制微球粒径的大小，使其静脉注射后，通过机械性截留于肺部，提高肺部药物浓度，一般认为粒径7微米的微球有良好的肺靶向性；同时，制备肺靶向微球的材料必须

4、是生物可降解材料如白蛋白、明胶、聚乳酸、壳聚糖、海藻酸钙等，既有良好的生物相容性，又有理想的控制释药特性。, 肺靶向纳米粒 以纳米粒(Nanoparticles)作为肺靶向药物载体，将会提高疗效，减少毒副作用。已研究的肺靶向纳米粒包括纳米囊、纳米球、脂质纳米粒、纳米乳和聚合物胶束。, 肺靶向脂质体 脂质体(Liposome)是指将药物包封于类脂双分子层组成的闭合囊泡，可以通过各种途径进入血液循环，如口服、静脉注射、肌肉注射等。它大部分选择性地分布于富含吞噬细胞的网状内皮细胞组织(RES)，从而导致肝脾对包封药物的滞留总量明显增加。脂质体分布的另一特点，只有较少量的进入心肌，骨骼和神经组织，这一

5、性质特别适用于对肾脏、心脏有毒性的药物临床应用，尤其是对正常细胞有毒性的抗癌药物，药物在心脏和肾脏的累积量比游离药物低。,为增加脂质体包裹药物对肝脾以外的器官、组织、细胞的病灶靶向作用，近年来主要集中在长循环脂质体的研究，该脂质体减少了RES清除，延长了药物在血液中的滞留时间，增强了非肝脾组织的分布。同时还采用触发释药系统给药，在此系统中药物受pH、温度或磁场改变的影响而在预期部位自脂质体释放。也有利用配体专一靶向给药系统，从而提高对其组织的靶向性作用。据文献报道，脂质体包裹的药物在体内的处置与定位会受到脂质体粒径、表面电荷、脂质组成等的影响。许多研究者已报道负电荷脂质体在肺部的蓄积大于相同粒

6、径的中性或正电荷脂质体，当然，也有报道正电荷脂质体在肺部药物浓度最高。目前，并没有一个统一的认识。另外，用多种改性多糖对脂质膜进行修饰，可达到增加肺主动靶向的作用。,三 脂质体的分类及新型靶向脂质体 脂质体的分类 1.脂质体按照所包含类脂质双分子层的层数不同，分为单室脂质体和多室脂质体。 小单室脂质体(SUV)：粒径约0.020.08um；大单室脂质体 (LUV）为单层大泡囊，粒径在0.1lum。 多层双分子层的泡囊称为多室脂质体 (MIV)，粒径在15um之间。 2.按照电荷分：中性脂质体，负电荷脂质体，正电荷脂质体 3.按照性能分：一般脂质体，特殊功效脂质体,新型靶向脂质体 1、前体脂质体

7、：1986年英国学者Payne等提出了前体脂质体(proliposomes)这一概念，系将磷脂、药物及附加剂等以适宜方法制成的不具备完整脂质双分子层囊泡结构的固态制剂，经水化即能转化成脂质体。由于尚未形成脂质双分子层结构，因此称之为前体脂质体。，前体脂质体的制备方法较简单，贮存稳定性比相应的脂质体混悬液大大提高，但至今仍未见前体脂质体制剂产品上市。主要原因是：前体脂质体的质量不易控制，如仅靠水化操作制备的脂质体粒径分布不够均匀；水溶性药物的包封率常达不到要求；作为静脉给药的脂质体制剂，热原、无菌难以控制；对前体脂质体研究的深度和广度均不够，尚未形成一种制备前体脂质体的技术平台。,2、长循环脂质

8、体：经过PEG修饰，以增加脂质体的柔顺性和亲水性，通过单核-巨噬细胞系统吞噬，减少脂质体脂膜与血浆蛋白的相互作用，延长循环时间，称为长循环脂质体(long-circulatingliposome)。长循环脂质体有利于肝脾以外的组织或器官的靶向作用。同时，将抗体或配体结合在PEG的末端，既可保持长循环，又可保持对靶体的识别。,3、免疫脂质体：脂质体表面连接抗体，对靶细胞进行识别，提高脂质体的靶向性。如在丝裂霉素（MMC）脂质体上结合抗胃癌细胞表面抗原的单克隆抗体3G制成免疫脂质，在体内该免疫脂质体对胃癌靶细胞的M85杀伤作用比游离MMC提高4倍。 4、热敏脂质体：利用在相变温度时，脂质体的类脂质

9、双分子层膜从胶态过渡到液晶态，脂质膜的通透性增加，药物释放速度增大的原理制成热敏脂质体。例如将二棕榈酸磷脂（DPPC）和二硬脂酸磷脂(DSPC)按一定比例混合，制成的3H甲氨喋呤热敏脂质体，再注入荷Lewis肺癌小鼠的尾静脉后，再用微波加热肿瘤部位至42，病灶部位的放射性强度明显的高于非热敏脂质体对照组。,5、pH敏感性脂质体：由于肿瘤间质的pH比周围正常组织细胞低，选用对pH敏感性的类脂材料，如二棕榈酸磷脂或十七烷酸磷脂为膜材制备成载药脂质体。当脂质体进入肿瘤部位时，由于pH的降低导致脂肪酸羧基脂质化成非相层结构，从而使膜融合，加速释药。总之，脂质体作为药物载体是临床应用较早，发展最为成熟的

10、一类新型靶向制剂。,四 脂质体的制备方法 传统上，人们采用最多的是被动载药法，它们的共同特点是：在装载过程中脂质体的内外水相药物浓度一致，决定其包封率的因素为药物与磷脂膜的作用力，膜材的组成，脂质体的内外水相体积及脂质体数目等。薄膜分散法、逆向蒸发法、冷冻干燥法、注入法、超声波分散法等均属于被动载药的制备方法。,被动载药法 （1） 薄膜分散法,磷脂 胆固 醇 药物 （脂溶性）,氯仿、乙醚,旋转蒸发,形成薄膜,磷酸缓冲液,搅拌,脂质体,（2） 逆相蒸发法,1,膜材磷脂等,氯仿、乙醚,待包封药物水溶液,乳化,W/O,减压蒸发,滴加缓冲液,脂质体,（3） 冷冻干燥法,磷脂和胆固醇及脂溶性药物分散于缓

11、冲溶液中，经超声波处理与冷冻干燥，再将干燥物分散到含药物的水性介质中，即得,（4） 注入法,磷脂、胆固醇和脂溶性药物共溶于乙醚中；缓缓注射于50 oC磷酸缓冲溶液中（可含水溶性药物）搅拌；搅拌蒸发乙醚除尽为止，得大多室脂质体。粒径较大，不适于静脉注射。需超高压均质。,（5） 超声波分散法,将水溶性药物溶于磷酸缓冲溶液中，加磷脂、胆固醇及脂溶性药物共溶于有机溶剂中，搅拌蒸发除去有机溶剂，残液经超声波处理，,对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高及水溶性较好的药物，被动载药法较为适用。如TFu(脂溶性高)能分布在脂质双分子层中，脂质体对这类药物的包封率很高(80)。而对于水溶性药物采用逆相蒸发法包封率很高

12、，因为水溶性药物可以溶解在脂质体的内水相中，尤其是水溶性较好的药物包封率较高。而对于两亲性药物其油水分配系数受介质的pH值和离子强度的影响较大，包封条件不易掌握，包封率不会太高，这种情况就应该采用主动载药法。,主动载药法 主动载药法，即通过内外水相的不同离子梯度载药，主要有K+-Na+梯度和pH梯度等。这种载药法可大大提高两亲性药物的包封率(特别是弱酸、弱碱类药物)还能降低药物的泄露。 对于弱酸弱碱类药物的包封，pH梯度较为常用。pH梯度驱动载药是通过形成脂质体内外水相跨膜的离子或化合物梯度最终建立起脂质体内外pH值梯度，使脂质体外水相药物自发的向脂质体内部聚集的方法。以一元弱碱为例，其原理如

13、下图所示,外水相pH较高时(接近药物的pKa值)，药物大多以分子态存在，分子态的亲脂性强，容易穿过磷脂双分子膜进入内水相，内水相中pH值较低，药物消耗一个质子后以盐的形式存在，其亲水性增强，不易穿过双分子膜返回外水相。在pH梯度作用下，外水相中的药物通过脂质双分子膜不断扩散到内水相中，这个过程一直持续到内水相与外水相中药物浓度与氢离子浓度比相等。因此，若内外水相的pH=3，药物在内水相的最终浓度为外水相的1000倍。,五 脂质体的质量评价与控制 5.1、形态、粒径及其分布 采用扫描电镜、激光散射法或激光扫描法测定。根据给药途径不同要求其粒径不同。如注射给药脂质体的粒径应小于200nm，且分布均

14、匀，呈正态性，跨距宜小。,5.2 包封率和载药量 包封率：包封率（脂质体中包封的药物/脂质体中药物总量）100 一般采用葡聚糖凝胶、超速离心法、透析法等分离方法将溶液中游离药物和脂质体分离，分别测定，计算包封率。通常要求脂质体的药物包封率达80%以上。 载药量：载药量脂质体中药物量/（脂质体中药物载体总量）100 载药量的大小直接影响到药物的临床应用剂量，故载药量愈大，愈易满足临床需要。载药量与药物的性质有关，通常亲脂性药物或亲水性药物较易制成脂质体。,5.3 脂质体的稳定性 （1）物理稳定性:主要用渗漏率表示。 渗漏率（放置前介质中药物量放置后介质中的药量）/制剂中药量x100% 胆固醇可以

15、加固脂质双分子层膜，降低膜流动，可减小渗漏率。 （2）化学稳定性： 磷脂氧化指数 磷脂量的测定：基于每个磷脂分子中仅含1个磷原素，采用化学法将样品中磷脂转变为无机磷后测定磷摩尔量（或重量），即可推出磷脂量。,5.4 防止氧化的措施： 防止氧化的一般措施有充入氮气，添加抗氧剂-生育酚、金属络合剂等；也可直接采用氢化饱和磷脂。 5.5 脂质体的灭菌： 灭菌的一般方法有滤过除菌、无菌操作、射线照射（60钴1520kGy）、121热压灭菌等。,六 脂质体肺靶向性评价 研究肺靶向制剂最重要的意义在于它改变了普通制剂给药后体内的广泛分布现象，提高药物在靶器官中的分布，从而达到提高疗效，降低毒副作用的目的。

16、根据相关文献多以相对摄取率(Re)、靶向效率(Te)、总靶向系数(TCe)、重量-总靶向系数(TQe)和峰浓度比(Ce)5个靶向参数对脂质体进行肺靶向性评价。,6.1相对摄取率(Re) 相对摄取率(Re)值是两种释药系统对同一组织相对靶向效率的评判指标，其计算公式如下： Re= (AUC)liposomes /(AUC)injection 当Rel时，表示药物制剂在该器官或组织有靶向性，Re愈大，靶向效果愈好；等于或小于1表示无靶向性。,62靶向效率(Te) 靶向效率(Te)反映了一个释药系统对靶组织和非靶组织的药物分布效率，表示药物制剂对靶器官的选择性，其计算公式为： Te=(AUC)lun

17、g targeted/(AUC)untargeted 当Te值1时，表示药物制剂对靶器官比非靶器官有选择性，Te值越大，选择性越强。,63总靶向系数(TCe) 总靶向系数(TCe)值表示药物在某一组织的分布占所有组织分布的比例，其计算公式为： TCe=AUCi/AUCi 脂质体的TCe与注射液的TCe的比值，表示药物制成脂质体后，药物在该组织分布增加的倍数。,64重量-总靶向系数(TQe) 重量-总靶向系数(TQe)表示在同一时间点靶器官中药物量占测得各脏器中总药量的药物百分比，其计算公式如下： TQe=AUQi/AUQi 由于各组织的重量或容量相差较大，所以AUC不能较好地反映药物在不同组织

18、的分布情况。为充分体现药量因素，引入组织重量或容量的概念，以AUQ(AUCixWi)代替AUC计算出的指标TQe称为重量总靶向系数。,65峰浓度比(Ce) 峰浓度比（Ce）为两种药物制剂峰浓度比值，其计算公式为： Ce=Cmax（liposoem）/Cmax(injection) 每个组织或器官中Ce值的大小，表明药物制剂改变药物在该组织器官中的分布效果，Ce值愈大，表示制剂改变药物分布的效果愈明显。,由于同一制剂进入体内后在不同组织中的分布靶向性不仅与药物在靶组织中的浓度有关，也与该组织的重量有关，因此引入重量-总靶向系数(TQe)来评价靶器官的药物量占同一时间点测得各脏器中总药量的药物百分

19、比，不难发现，TQe更能准确评价某一靶向制剂在不同组织中的靶向性。从这个意义上来说，肺靶向的脂质体较普通制剂在肺组织中的药物浓度显著提高直接反映了脂质体对肺组织的靶向性显著优于普通制剂；而肺部组织中的药物量占所测得各脏器中总药量的相对百分含量则反映了与普通制剂相比，表明了该脂质体相对提高的程度。,七 肺靶向脂质体研究的实例 7.1被动肺靶向脂质体制剂 王健松等以薄膜蒸发法结合冻融法制备的阿奇霉素脂质体，具体过程如下：称取卯磷脂、胆固醇、十八胺和阿奇霉素适量，用氯仿溶解后置茄形瓶中，37经旋转蒸发仪真空抽干氯仿后，加入5甘露醇溶液，37水浴常压下水合45min，使得薄膜溶胀水化，所得的脂质体混悬

20、液用3m微孔滤膜过滤。滤液于20冰箱放置，12h后取出，于室温下融化，如此重复3次，即得阿奇霉素脂质体溶液。结果得到的脂质体平均粒径为6582微米，表面电荷为+19.5 mv；小鼠尾静脉给药后阳离子脂质体主要被肺摄取，在肺部的滞留时间明显延长，AUC值约为阿奇霉素溶液的84倍。,根据以上图表可知：阿奇霉素溶液在小鼠 心、肝、脾、肺、肾组织中分布明显高于血液中的分布，而且在所有组织中的半衰期都较长，这与文献报道基本相符。与溶液组相比，阿奇霉素脂质体组肝、脾中的分布较高。这是因为肝脾组织中富含网状内皮细胞，而且从粒径分布图中可以看出，脂质体混悬液中有部分粒子在2微米左右，而小于2微米的微粒一般被肝

21、、脾中的巨噬细胞摄取，因此脂质体进入体内后在肝脾中摄取量要高于溶液组。,阳离子阿奇霉素脂质体在肺中的分布远远高于其他组织，与溶液组相比，阿奇霉素浓度大大提高，同时AUC值增加了74倍，消除半衰期从1601 h提高到2374 h，说明阿奇霉素脂质体在小鼠肺部有一定的缓慢释放。与溶液组相比，脂质体组在血液中的分布大大减少，AUC值为57， T1/2也从原来的3402 h降低到2062 h。这可能是因为阿奇霉素脂质体更容易被富含网状内皮细胞的肝脾组织摄取，而且由于被动靶向，大多数分布在肺部，从而进入血液中的药量减少。用靶向性评价参数进行靶向性分析，比较靶向系数te发现，脂质体给药后，显著改变了阿奇霉

22、素在体内组织的分布，溶液组体内组织靶向分布趋势为脾，肝、肾、肺、心、血液，肺中的靶向百分比仅为1087，脂质体组体内组织靶向分布改变为肺、肝、脾、肾、心和血液，其中肺部靶向百分比提高4466。,脂质体组相对于注射液组对阿奇霉素的相对摄取率Re为8391(1)；峰浓度比Ce为1307(1)远远高于其他组织。实验表明，阿奇霉素阳离子脂质体不仅提高了肺部靶向性，在肺部还具有一定的缓释作用。这主要是因为肺部毛细血管丰富，大于2m的脂质体，有趋向肺内停留，大于6m，通常被肺部的最小毛细血管床以机械滤过方式截留，被单核白细胞摄取进入肺组织或肺气泡。同时，表面带正电荷的粒子，由于静电作用，更容易被肺组织摄取

23、。因此，大粒径带正电荷是制备被动肺靶向脂质体的关键因素。,7.2 主动肺靶向脂质体制剂 程骥等首先合成棕榈酰化支链淀粉：将支链淀粉lg混悬于DMSO10 mL中，70 水浴加热，搅拌直至彻底溶解。加入无水吡啶1mL及棕榈酰氯01g，继续加热、搅拌2h，室温放置至冷，缓慢倾倒入无水乙醇100mL中，收集沉淀，分别用无水乙醇100mL和无水乙醚80mL洗涤，50真空干燥2h即得棕榈酰化支链淀粉；然后利用棕榈酰化支链淀粉制备双嘧达莫脂质体，其具体过程：称取处方量的双嘧达莫、蛋黄磷脂、胆固醇溶于氯仿，置梨形烧瓶中，减压蒸去氯仿形成脂质薄膜，加入pH7.4PBS充分振荡水合，制得载药脂质体混悬液。结果得

24、到的脂质体粒径为386m，正电荷212mv，小鼠体内的组织分布显示修饰后的脂质体在肺部浓度是普通制剂的4倍。这可能是修饰后的脂质体由于结合于表面的支链淀粉可以促进脂质体与肺血管内皮细胞的结合，并特异性地被肺泡巨噬细胞摄取，从而使脂质体更易于穿过肺部毛细血管壁，主动靶向于肺部。,研究表明，采用支链淀粉等多种多糖修饰脂质体表面可以增加脂质体在肺部的分布，增强治疗肺部疾病的效果。本例首先制备棕榈酰化支链淀粉(OPA)，使其带有亲脂性基团，可以插入脂质双分子层，牢固地与脂质体结合。 由DIPL的透射电镜照片中可见外观圆整的囊状结构，ODIPL的透射电镜照片中可见脂质体内层囊状结构变得不清晰，推测OPA

25、已经有效地结合于脂质体表面；修饰后脂质体包封率下降，这可能是由于DIP是亲脂性药物，包裹于脂质双分子层中，而OPA的修饰占据了部分DIP的结合位置所致；修饰后脂质体表面zeta电位有所增加，这是由于OPA带有一定的正电荷之故；但修饰后粒径和径距均无明显变化。,由组织分布数据结果可见，DIPL组肺部AUC值显著高于DIPI组，ODIPL组又显著高于DIPL组，表明脂质体包裹可使DIP在肺部的分布大大增加，而经支链淀粉表面修饰后，药物在肺部的分布又得到进一步地增加；DIPL组肺部MRT较DIPI组有显著地延长，说明脂质体包裹使DIP在肺部的消除减慢，滞留时间延长，而ODIPL使药物在肺部的DIP消除更慢。肺靶向性参数结果表明，DIPL除了具有较强的肺靶向性之外，还具有一定的肝脾靶向性，而ODIPL的肺靶向性比DIPL大大提高，且肝脾靶向性有所下降。这是因为未经修饰的DIPL的平均粒径为375m，iv给药后，由于DIPL带正电，有部分较大粒径的微粒较易被肺部毛细血管床机械性截留，同时也有相当一部分的微粒被肝脾的网状内皮细胞所吞噬；而修饰后的脂质体由于结合于表面的支链淀粉可以促进脂质体与肺血管内皮细胞的结合，并特异性地被肺泡巨噬细胞摄取，从而使脂质体更易于穿过